lunes, 3 de junio de 2013

TAREA # 1 DE LA UNIDAD # 5...

TÉCNICAS  DE SOUTHERN Y NORTHERN.

La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.
Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus obacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.

La PCR 
Sensibilidad: se refiere a la cantidad mínima de ADN necesaria para que se produzca la amplificación, es decir, para obtener una banda. Se relaciona con los falsos negativos, ya que puede que una muestra sea positivas pero sea dada como negativa porque no se ha amplificado por no tener suficiente cantidad de ADN.
Especificidad: se refiere a la obtención de un solo producto amplificado. Viene determinada por los oligos y la especificidad con la que se unen al ADN molde. De esta forma, si los oligos tienen más de un sitio al que se pueden unir aparecerá más de un producto amplificado.
Eficiencia: se refiere a la amplificación máxima que se puede obtener en un número determinado de ciclos.
Fidelidad: se refiere a los errores que comete la ADN polimerasa durante la amplificación. Este concepto es de especial importancia en la secuenciación, pero en otros casos no es tan importante. Una buena fidelidad permite evitar falsos positivos y/o negativos.

 Southern:
 es un método de biología molecular que permite detectar la presencia de una secuencia de ADN en una mezcla compleja de este ácido nucleico. Para ello, emplea la técnica de electroforesis en gel de agarosa con el fin de separar los fragmentos de ADN de acuerdo a su longitud y, después, una transferencia a una membrana en la cual se efectúa la hibridación de la sonda. Su nombre procede del apellido de su inventor, un biólogo inglés llamado Edwin Southern.

Pasos de Southern
1. Extracción del ADN
Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano. Las posibles fuentes de ADN en la escena de un delito incluyen sangre, semen, tejido de una víctima muerta, células del folículo capilar y saliva. El ADN extraído de las pruebas del delito ("indicios" o "vestigios" biológicos) se compara con el extraído de muestras de referencia, obtenidas de personas conocidas,habitualmente de la sangre.
2. Digestión del ADN con una endonucleasa de restricción
El ADN extraído de la muestra se trata con una endonucleasa de restricción,que es una enzima que corta el ADN bicatenario en donde tenga una secuencia característica. La enzima que se usa más frecuentemente para el análisis legal es HaeIII, que corta el ADN en la secuencia 5'-GGCC-3'.
3. Electroforesis en gel de agarosa
Tras la digestión del ADN, los fragmentos de ADN resultantes se separan según su tamaño mediante electroforesis en geles de agarosa. Durante la electroforesis, las moléculas de ADN, que poseen carga negativa, migran hacia el electrodo positivo. Al avanzar las moléculas de ADN, su velocidad de migración se ve reducida por la matriz del gel de agarosa. Las moléculas menores se mueven más deprisa a través de los poros del gel que las de mayor tamaño. Como resultado, se produce una separación continua de los fragmentos de ADN de acuerdo con su tamaño, de modo que los fragmentos más pequeños avanzan la mayor distancia con referencia al origen o punto de aplicación de la muestra.
4. Preparación de un ensayo de Southern ("Southern blot")
Tras la electroforesis, las moléculas de ADN separadas se desnaturalizan mientras permanecen en el gel de agarosa, impregnando éste con una disolución alcalina. Tras la neutralización de ésta, el DNA monocatenario resultante se transfiere a la superficie de una membrana de nailon,realizando así una copia o "calco" (la traducción más literal del inglés blot,conservando este sentido, es "secante"). Este proceso de desnaturalización y transferencia se conoce como método de Southern en recuerdo de quien lo inventó, Edward Southern. Al igual que la aplicación de un secante a un papel con la tinta húmeda transfiere una réplica de la imagen del papel al secante,el "calco" del ADN en el gel a la membrana de nailon conserva la distribución espacial de los fragmentos de ADN conseguida en el gel como resultado de la electroforesis.
5. Hibridación con sonda radioactiva
Una sonda de locus único es una molécula pequeña de ADN o ARN capaz de hibridar (es decir, de formar un dúplex ADN-ADN o ADN-ARN) con el ADN de un fragmento de restricción concreto en el ensayo de Southern. La formación de la molécula dicatenaria (dúplex) depende del emparejamiento de bases complementarias entre las secuencias de la sonda y del ADN presente en el"calco". Las sondas de locus único se marcan habitualmente con un isótopo radiactivo para facilitar su detección, y se eligen para que detecten un locus genético polimórfico en un solo cromosoma humano. El ensayo de Southern resultante de la etapa 4 se incuba en una disolución que contiene una sonda radiactiva de locus único, bajo condiciones de temperatura y concentración desales que favorezcan la hibridación. Tras producirse ésta, se lava el exceso de sonda no unido, de modo que la única radiactividad que quede en la membrana de nailon sea la asociada al ADN del locus diana.
6. Detección de los RFLPs mediante autorradiografía
Las posiciones de hibridación de la sonda radiactiva sobre la membrana del ensayo de Southern se detectan mediante autorradiografía. En esta técnica,la membrana de nailon se coloca, una vez lavada, junto a una película derayos X dentro de una caja que las aísle de la luz. La película registra las posiciones donde hay desintegración radiactiva. Tras su exposición y el revelado fotográfico, el registro resultante de la hibridación de Southern se conoce como autor radiografía
7. Reensayar el resultado del Southern con sondas adicionales
En un análisis legal de DNA se suelen caracterizar polimorfismos de ADN en varios cromosomas diferentes. Tras el revelado de una autor radiografía para la primera sonda, se puede lavar la radiactividad con una disolución a elevada temperatura, que deja el ADN en su sitio, e hibridarlo con una segunda sonda radiactiva que se una a un locus diferente. Se repiten así las etapas 5-7, detectando cada vez un locus diferente. El grupo de autor radiografías de una misma transferencia de Southern se conoce como un "perfil de ADN"

Northern:

Es una técnica de detección de moléculas de ácido ribonucleico (ARN) de una secuencia dada dentro de una mezcla compleja (por ejemplo, un ARN mensajero para un péptido dado en una extracción de ARN total). Para ello, se toma la mezcla de ARN y se somete a una electroforesis en gel a fin de separar los fragmentos en base a su tamaño. Tras esto, se transfiere el contenido del gel, ya resuelto, a una membrana cargada positivamente en la cual se efectúa la hibridación de una sonda molecular marcada radiactiva o químicamente.
El nombre de la técnica deriva de la propia de la detección de ácido desoxirribonucleico (ADN), denominada Southern blot en honor a su descubridor; de este modo, al desarrollarse la técnica equivalente para ARN se empleó el punto cardinal opuesto («northern», septentrional en inglés, frente al meridional «southern»). El northern blot fue desarrollado en 1977 por James Alwine, David Kemp y George Stark en la Universidad de Stanford.

 

Procedimiento 

El procedimiento general comienza con la extracción del RNA total de una muestra de tejido homogenizado. El mRNA se puede aislar a través del uso de cromatografía para mantener solamente los ARN con colas de poli-A. Las muestras de ARN son entonces separadas por electroforesis en gel. Dada la fragilidad de los geles y la incapacidad de las sondas para penetrar en la matriz, las muestras de RNA, separadas por tamaño tras la electroforesis, serán tranferidas a una membrana de Nailon por medio de capilaridad o un sistema de transferencia al vacío.
Una membrana de Nylon cargada positivamente es el soporte más efectivo para usar en el northern blot ya que los ácidos nucleicos, que están cargados negativamente, tienen una alta afinidad por estas membranas.
 El buffer de transferencia usado para el ensayo suele contener formamida, dado que ésta consigue disminuir la temperatura de hibridación de la sonda, lo cual previene la degradación del ARN por las altas temperaturas. Una vez que el ARN ha sido transferido a la membrana, este es inmovilizado a través de enlaces covalentes formados con la membrana, lo cual se consigue por medio de luz ultravioleta o calor.
 Después del marcaje de la sonda, ésta se hibrida con el RNA en la membrana. Las condiciones experimentales que pueden afectar la eficiencia y especificidad de la hibridación están determinadas por las condiciones iónicas, de viscosidad, la presencia de dobles hebras de RNA, bases desemparejadas y composición de las mismas. Finalmente, la membrana debe de lavarse para asegurar que la sonda se ha unido de forma específica y para evitar ruido de fondo en las señales emitidas por la misma.
Estas señales serán detectadas porRayos X y pueden ser cuantificadas mediante técnicas de densitometría. Para crear controles y poder asegurarnos de que no se están mostrando genes que no nos interesen se puede realizar posteriormente la determinación por microarrays o RT-PCR.
Las muestras de RNA son normalmente separadas en geles de agarosa que contienen formaldehído como agente desnaturalizante del RNA para obtener su estructura secundaria.
Los geles pueden ser teñidos con bromuro de etidio y visualizados bajo luz ultravioleta para observar el RNA. Los geles de poliacrilamida con urea también pueden utilizarse, aunque esto suele limitarse a fragmentos de RNA o miRNA, ya que crean un tamaño de poro mas estrecho en su matriz, por lo que el RNA que suele utilizarse no podría desplazarse por el gel.
Suele utilizarse además un patrón de RNA con muestras de tamaño conocido para poder extrapolar el tamaño de las muestras en estudio.

Sondas 

Las sondas del northern blot están compuestas por ácidos nucleicos con una secuencia complementaria a todo o parte del RNA que nos interesa. Pueden ser de DNA, RNA o oligonucleótidos, con un mínimo de 25 bases complementarias para nuestra secuencia diana.
Las sondas de RNA o ribosondas que se transcriben in vitro ayudan a prevenir el ruido de fondo. Normalmente, el DNA complementario se sintetiza con cebadores para la secuencia RNA de interés para actuar como sonda en el Northern blot.
Las sondas requieren ser marcadas bien con isótopos radiactivos (32P) o con quimioluminiscencia, ya sea con fosfatasa alcalina o con peroxidasa de rábano, las cuáles, tras la adición de su sustrato específico producen una emisión de luz detectable.
El marcaje por quimioluminiscencia puede hacerse de dos formas: Por un lado, la sonda puede estar unida a la enzima o bien unida a un ligando (p.ej, biotina) para la cual hay un anticuerpo (avidina o estreptavidina en este caso) está unido a la enzima que revelará el marcaje.
Los Rayos X pueden detectar tanto las señales radioactivas como las quimioluminiscentes, siendo preferida por muchos investigadores la segunda, dada su mayor rapidez, sensibilidad y reducción de los riesgos para la salud que conlleva trabajar con compuestos radioactivos.

Aplicaciones 

El northern Blot permite observar un patrón particular de expresión genética entre tejidos, órganos, estadios del desarrollo, niveles de estrés ambiental, infecciones causadas por patógenos y durante el curso del tratamiento de las mismas. Esta técnica se ha utilizado para mostrar la sobreexpresión de oncogenes y la desregulación de genes supresores tumorales en células cancerosas cuando son comparadas con tejidos normales.
Los patrones de expresión obtenidos nos ayudan a conocer las funciones de los genes. Desde que el RNA se separó por su tamaño, las sondas contra el mismo pueden darnos una idea de su tamaño, sugerir ayuste alternativo, o motivos repetidos en la secuencia. La variación en el tamaño del producto de un gen puede además indicarnos deleciones o errores en el proceso de transcripción. Alterando la sonda podemos conocer la secuencia e incluso determinar que región del RNA ha sido delecionada.

Ventajas y Desventajas 

El análisis de la expresión génica puede realizarse por diversos métodos, como RT-PCR, Ensaños de protección de RNasa, microarrays, Análisis seriado de expresión génica así como el Northern Blot. Los microarrays son los mas utilizados y son generalmente consistentes con los datos obtenidos por el Northern Blot. No obstante, en ocasiones el Northern Blot es capaz de detectar pequeños cambios en la expresión de genes que los microarrays no pueden identificar.
Ventajas adicionales de usar el método de Northern Blot incluyen la habilidad de definir el tamaño de la cadena de ARN, la habilidad de observar los productos del empalme alternativo, la posibilidad de usar sondas con homología parcial, la habilidad de medir el tamaño y la calidad del ARN antes de realizar la inmovilización en la membrana y finalmente la opción de guardar la membrana para ser analizada en repetidas ocasiones en el futuro.
Un problema común del northern blot es que la degradación de la muestra por RNAsas (endógenas de la muestra o a través de contaminación ambiental) que puede ser evitada por una apropiada esterilización de los materiales así como el uso de inhibidores de RNAsas como el dietilpirocarbonato

 Northern Blot reverso 

Una versión alternativa del método es conocidad como Northern Blot reverso. En ésta, el ácido nucleico que actua como sustrato (fijo en la membrana) está conformado por fragmentos aislados de ADN, mientras que la sonda está conformada por ARN obtenido de los tejidos y etiquetada con material radioactivo.
Esta variante es más compatible con el uso de un chip de ADN, que se ha convertido en practica común en la parte final de la década de 1990 y la primera del siglo XXI. Ambas prácticas requieren la fijación de fragmentos de ADN como su hibridación con sondas de ARN celular. De esta manera el proceso en reverso, aunque inicialmente era poco común, permitió que el Northern Blot evolucionara hasta tener un lugar en el desarrollo de los perfiles de expresión génica.

CONCLUSIÓN GENERAL

Southern 

El método tipo Southern o Southern blot fue desarrollado para la detección de genes específicos en el ADN celular.
El ADN es digerido con una enzima de restricción y los fragmentos son separados por tamaños mediante electroforesis en un gel. A continuación los fragmentos de ADN de doble cadena son desnaturalizados mediante un proceso químico separando las dos hebras componentes del ADN en sus cadenas sencillas. Posteriormente, el ADN inserto en el gel es transferido a un filtro de nitrocelulosa, con lo que en el filtro queda representada una réplica de la disposición de los fragmentos de ADN presentes en el gel. A continuación el filtro se incuba durante un tiempo con la sonda marcada (radiactivamente o con un fluorocromo); durante la incubación la sonda se va hibridando con las moléculas de ADN de cadena sencilla de secuencia complementaria (o muy parecida). La sonda unida al fragmento de ADN complementario se puede visualizar en el filtro de una forma sencilla mediante una exposición a una película de rayos X para el caso de sondas radiactivas o con una película sensible a la luz, para el caso de sondas con fluorocromo

Northern 

El segundo método, tipo Northern blot o Northern, se utiliza para identificar las cadenas de ARN de secuencia semejante al ADN que se usa como sonda; a diferencia del tipo Southern que se utiliza para identificar ADN, el método Northern sirve para identificar ARN.

El ARN se extrae y se fracciona en tamaños variables mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida en unas condiciones que mantengan las cadenas de ARN en estado desnaturalizado. El proceso continúa de forma semejante a la hibridación de tipo Southern. El método del Northern se utiliza muy frecuentemente para realizar estudios de expresión génica; para conocer qué genes están activos formando ARN mensajero en qué condiciones, en qué tejidos o tipos celulares.

jueves, 9 de mayo de 2013



RESUMEN DE LA UNIDAD # 3…° TÉCNICAS IN VITRO EN EL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES.

El cultivo in vitro el desarrollo  y crecimiento de plantas o partes de plantas en condiciones especiales, dentro de recipiente de vidrio. En estas condiciones se le debe sumisnistra a la planta todo lo que necesita para su desarrollo: agua, nutriente, luz y agua. El agua y los nutrientes se aportan con el medio y la luz la reciben a través de las paredes de vidrio.

Es vital  importancia  que  el  medio,  los  frascos,  los  aparatos  y las  semillas  se  mantengan desinfectadas  desde el principio del proceso de germinación.  Cualquier bacteria u hongo que se introduzca en los frascos crecerá  más rápido que las semillas y pronto ocupará su espacio hasta matarlas

El término genérico “cultivo de tejidos vegetales involucra a diferentes técnicas de cultivo de material vegetal diverso, incluyendo a los protoplastos (células desprovistas de su pared celular), lulas, tejidos, órganos y plantas completas. Mediante éstas y otras técnicas de cultivo, es posible obtener plantas libres de microbios en un medio nutritivo aséptico (estéril) en condiciones ambientales controladas. También se lo conoce como “cultivo in vitro de plantas” por realizarse en recipientes de vidrio (hoy también de otros materiales).
Las primeras experiencias relacionadas con el cultivo de tejidos vegetales se remontan a 1902, pero recién en 1922 se logró el primer experimento exitoso: la germinación in vitro de semillas de orquídeas. Luego de la germinación, las plántulas obtenidas se transfirieron a un medio de cultivo en condiciones asépticas, y así se mantuvieron protegidas del ataque de patógenos (hongos, virus y bacterias).
Hoy esta técnica tiene numerosas aplicaciones, algunas de ellas se ilustran en la Figura 1:


      Propagación masiva de plantas, especialmente para especies de difícil propagación por otros métodos, o en vías de extinción.

   Clonación de individuos de características agronómicas muy deseables durante todo el año.

      Obtención de plantas libres de virus.

      Producción de semillas sintéticas.

      Conservación de germoplasma (conjunto de individuos que representan la variabilidad genética de una población vegetal).

      Obtención de metabolitos secundarios.

      Producción de nuevos híbridos.

      Mejora genética de plantas (incluyendo obtención de plantas transgénicas).

      Germinación de semillas.

      Producción de haploides.

      Estudios fisiológicos diversos.





Figura 1. Algunas aplicaciones del cultivo de tejidos en plantas. En la de ariba, micropropagacn de violeta africana a partir de trozos de hojas desinfectados e introducidos en condiciones de  esterilidad. En la de abajo, semillas sintéticas formadas por embriones somáticos obtenidos por  cultivo de células, encapsulados en una matriz inerte (como el alginato de calcio).


Las bases biológicas del cultivo de tejidos: la totipotencialidad celular


La reproducción asexual de plantas por cultivo de tejidos es posible gracias a que, en general, varias células de un individuo vegetal poseen la capacidad necesaria para permitir el crecimiento y el desarrollo de un nuevo individuo completo, sin que medie ningún tipo de fusión de lulas sexuales o gametas. Esta capacidad se denomina totipotencialidad celular, y es característica de un grupo de células vegetales conocidas como células meristeticas, presentes en los distintos órganos de la planta. La potencialidadde una célula diferenciada (una célula de conducción, epidérmica, etc.)

para generar tejidos nuevos y eventualmente un organismo completo, disminuye con el grado de diferenciación alcanzado por esa célula, pero puede revertirse parcial o completamente según las condiciones de cultivo a las que se la someta. Las lulas vegetales crecidas en condiciones asépticas sobre medios de cultivo adicionados con hormonas vegetales, pueden dividirse dando dos tipos de respuesta:
      una desdiferenciación celular acompañada de crecimiento tumoral, que da lugar a una masa de células indiferenciadas denominada callo, la cual bajo las condiciones adecuadas es capaz de generar órganos o embriones somáticos (llamados así porque son estructuras similares a un embrión, pero que no se originaron por unión de gametas),

      una respuesta morfogenética por la cual se forman directamente órganos (organogénesis) o embriones (embriones somáticos).


La primera respuesta se conoce como organogénesis o embriogénesis indirecta (mediada por un estado de callo) mientras que la segunda respuesta se considera organogénesis o embriogénesis directa.

El cultivo in vitro consiste en tomar una porción de una planta (a la que se denomina explanto, como por ej. el ápice, una hoja o segmento de ella, segmento de tallo, meristema, embrión, nudo, semilla, antera, etc.) y colocarla en un medio nutritivo estéril (usualmente gelificado, semisólido) donde se regenerarán una o muchas plantas.
La formulación del medio cambia según se quiera obtener un tejido desdiferenciado (callo), crecer yemas y raíces, u obtener embriones somáticos para producir semillas artificiales.

El éxito en la propagación de una planta dependerá de la posibilidad de expresión de la potencialidad celular total, es decir, que algunas células recuperen su condición meristemática. A tal fin, debe inducirse primero la desdiferenciación y luego la rediferenciación celular. Un proceso de este tipo sucede durante la formación de las raíces adventicias en el enraizamiento de estacas, la formación de yemas adventicias, o cuando se busca la propagación de begonias, violeta africana (ver figura 1) o peperonias mediante porciones de hojas. Uno de los factores más importantes a tener en cuenta para lograr la respuesta morfogenética deseada es la composición del medio de cultivo.

No existen dudas que en todo intento de propagación vegetal, ya sea in vitro o in vivo, el carácter del proceso de diferenciación depende del genoma de la especie, y que está regulado por el balance hormonal propio y por el estado fisiológico del órgano, tejido o lula puesta en cultivo. Sin embargo, también se sabe que ese balance puede ser modificado por el agregado de compuestos que imiten la acción de las hormonas vegetales. Estos compuestos se denominan reguladores del crecimiento, y se emplean en los medios de cultivo para conseguir la micropropagación de una planta.

La totipotencialidad celular es clave en el desarrollo de plantas genéticamente modificadas o transgénicas. Una vez realizada la transformación, ya sea por Agrobacterium o por el método de biobalística, el paso siguiente es el cultivo in vitro, con el fin de obtener, a partir del explanto inicial transformado, plántulas que lleven el transgén en todas sus células (Figura 2).



Figura 2. Cultivo de tejidos y transformación vegetal. En la figura se observan explantos que, luego del proceso de  selección, han perdido coloración y aquellas lulas  transformadas exitosamente que se han desdiferenciado y  rediferenciado para dar origen a un brote



Pasos necesarios para generar plantas a partir de explantos aislados


En  los  protocolos utilizados  durante  el  cultivo  ivitro  se  pueden  distinguir  las  siguientes etapas
(sintetizadas en la Figura 3):

1)   Elección de la planta y/o tejido donante de explantos.

2)   Establecimiento, que consiste en la desinfección de los explantos (generalmente con hipoclorito de sodio) y su posterior adaptación al medio artificial de modo de inducir callo, brote, raíz o embrión somático según se desee.

3)  Multiplicación, para generar una masa vegetal suficiente para la regeneración del mero de plantas necesarias.

4)   Enraizamiento, en la que se busca la formación de raíces con el fin de convertir los brotes o embriones somáticos en plántulas completas.

5)   Rusticación,  que  es  la  aclimatación  de  las  plántulas  obtenidas  in  vitro  a  las  condiciones ambientales ex vitro (suelo o algún sustrato inerte)


El éxito de la técnica depende de muchos factores, entre ellos la edad de la planta (a mayor edad, menor potencial de regeneración), el genotipo y las condiciones ambientales.



Entre las ventajas del cultivo in vitro de material vegetal, se pueden incluir los tiempos más cortos, y la posibilidad de ocupar un espacio mucho más pequeño que si se desea propagar material en tierra.


Figura   3.      Etapas  de   la   regeneración   in  vitro  del  maíz.



Elementos necesarios para el cultivo de tejidos vegetales



 Para llevar adelante este trabajo, se necesitan equipamientos que generen  las condiciones necesarias de esterilidad, como los flujos laminares, que son estaciones de trabajo que hacen circular aire filtrado y estéril, protegiendo así a la muestra con la que se desea trabajar (Figura 4).



Figura   4.  Flujo  laminar  para  el  cultiv de tejidos. Se observa uno de los modelos  de flujo laminar  que  puede   usarse   para  preservar  la esterilidad de  las muestras


Además, se necesita un soporte para el explanto, que puede ser sólido o líquido, y que es conformado por algún agente gelificante inerte (agar, gelrite, etc.), macro  y micronutrientes  esenciales  para la supervivencia de la planta, nutrientes (hidratos de carbono, vitaminas),  agentes reguladores   del crecimiento y hormonas vegetales (ver Tabla 1) que ayudarán a obtener una planta o un órgano en particular, a partir del explanto elegido. Algunos de los elementos  mencionados  pueden  ser  reemplazados por mezclas poco definidas en su composición (jugo de  tomate,  agua  de  coco,  etc.)

 Que  pueden  dar buenos resultados y generalmente resultan más económicas. La acidez de los medios de cultivo para plantas  suele  variar  entre  pH=5  y  6,5.  Luego  se regulan  las condiciones de temperatura  y de fotoperíodo (relación de horas luz y horas oscuridad).

Según sea el balance hormonal y otras condiciones de cultivo, se puede propiciar la regeneración de distintos órganos o formaciones vegetales. Por ej., si el balance de citoquininas/auxinas (ver Tabla 1) es mayor que 1, se favorece la generación de brotes; si es menor que 1, la generación de raíces; y si es igual a 1, la formación de callos.


Tabla 1. Composición de medios de cultivo para células vegetales


Componentes
Características y ejemplos
Agua destilada
Representa el 95% del medio nutriente


Fuente de carbono

Generalmente se usa sacarosa. La fuente de carbono se necesita porque los explantos no son completamente autótrofos, y no pueden cubrir sus necesidades con la fotosíntesis que pueden realizar in vitro

Sustancias inorgánicas
Macroelementos (N, P, K, Ca, Mg, S) y microelementos (Fe, Co, Zn, Ni, B, Al, Mn, Mo, Cu, I), en una proporcn adecuada según la planta elegida.

Vitaminas
Vitaminas B1, B2, B6, vitamina H, vitamina E, ácido fólico, ácido nicotínico, entre otras.



Hormonas y reguladores del crecimiento
Auxinas: promueven la elongación celular, la formación de callos y raíces adventicias, inhiben la formación de brotes axilares adventicios y, a veces, inhiben la embriogénesis.
Citoquininas: promueven la división celular, regulan el crecimiento y el desarrollo de los tejidos vegetales.
Otras: giberelinas, ácido abscísico, etileno.
Mezclas de sustancias poco definidas
Extracto de levadura, extractos vegetales.

Materiales inertes
Se usan como soporte: agar, agarosa, otros polisacáridos, lana de vidrio, papel de filtro, arena.




El cultivo in vitro y la biotecnología:


   



Figura 5. La micropropagación  vegetal.  A partir  de  una  planta   madr se  obtienen numerosos explantos              que,   sujetos  a condiciones y medios de cultivo  adecuados, darán  lugar  a  nuevas  plantas  iguales  a  la planta original, permitiendo su multiplicación.




 La micropropagación


La propagación de plantas in vitro es una técnica muy utilizada en cultivos de importancia económica. Permite cultivar células, tejidos, órganos, semillas, embriones y obtener individuos selectos en forma rápida. Los cultivos son realizados  por  personal  especializado  en  medios específicos (hormonas, minerales, vitaminas, fuente de carbono, agente gelificante, agua, etc.) y condiciones ambientales controladas (temperatura, humedad y luz) (Figura 5). Una vez ajustados los protocolos para la especie o cultivo de interés, es posible automatizar el proceso de modo de llevarlo a mayor escala de producción.
La micropropagación (propagación clonal por cultivo in vitro) constituye uno de los métodos biotecnológicos que mayores logros ha aportado al desarrollo de la agricultura, ya que se la usa en la producción masiva de especies hortícolas, aromáticas, medicinales, frutícolas, ornamentales y forestales

Entre las ventajas de la micropropagación se pueden mencionar:
-     Posibilita incrementar rápidamente nuevos materiales.
-     Permite controlar las condiciones ambientales, debido a su independencia de los mismos (luz, temperatura y humedad controlada).
-     Permite estudiar diversos procesos fisiológicos.
-     Evita el riesgo de contaminación con patógenos, ya que se realiza en medios esterilizados.
-     Se pueden obtener gran cantidad de individuos en espacios reducidos.
-     Permite la obtención de individuos uniformes.
-     Facilita el transporte del material.



El cultivo de meristemas





Figura 6. Cultivo de meristemas. A partir de un meristema aislado se puede obtener una planta  completa. Adaptado de Biotecnología,


En la yema apical se encuentran un grupo de células que conforman el meristema apical (tiene un tamaño entre 0,01 y 0,3 mm), tejido embrionario que tiene la capacidad de formar todos los tejidos de la planta. A partir de ellos se pueden regenerar plantas completas (Figura 6).

El cultivo de meristemas tiene numerosas aplicaciones. Una de las más importantes es la obtención de plantas libres de virus, ya que esta pequeña zona de tejido generalmente no es afectada por estos patógenos vegetales. Otra muy importante es la multiplicación vegetal. La potencialidad de la técnica se demuestra con un ejemplo: a partir de una yema apical, se pueden obtener 4.000.000 de claveles en un año. La técnica permite también multiplicar especies de plantas con reproducción lenta o dificultosa (como las orquídeas), o acelerar la producción de plantas bianuales.

Cultivo de células y órganos vegetales en biorreactores


Una vez obtenidos los callos a partir de algún explanto, los mismos pueden disgregarse para obtener una suspensión de células. Esta suspensión puede utilizarse para generar embriones somáticos (la base  de  las  semillas  sintéticas),  o  puede  directamente  cultivarse  para  producir  metabolitos secundarios, que son compuestos químicos sintetizados por las células vegetales en determinadas condiciones, con gran utilidad para las industrias farmacéutica y alimenticia, entre otras. Por ejemplo, son metabolitos secundarios el mentol y las drogas anticancerígenos vincristina y taxol, y algunos edulcorantes. Los cultivos celulares se llevan a cabo en biorreactores, que son recipientes de distinta capacidad  (de  unos  pocos  a  miles  de  litros),  diseñados  para  propiciar  el  crecimiento  y/o  la multiplicación de distintos tipos de células y/o órganos (Figura 7).


Las raíces vegetales también pueden ser cultivadas en biorreactores, especialmente aquellas transformadas por Agrobacterium rhizogenes, que produce un aumento abrupto en el tamaño y ramificación de la raíz, aumentando así la biomasa, y por ende la cantidad del producto deseado. Un ejemplo de compuesto farmacológico producido por cultivo de raíces es el paclitaxel, o taxol, que es utilizado como anticancerígeno.






Figura 7. Cultivo de lulas y órganos vegetales. A partir de un explanto se pueden establecer  cultivos de células para producir compuestos de interés, o para obtener embriones somáticos y  semillas artificiales, entre otras aplicaciones. Adaptado de “Biotecnología”, UNQ 2006






BIBLIOGRAFIA


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Editorial Continental
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