jueves, 9 de mayo de 2013



RESUMEN DE LA UNIDAD # 3…° TÉCNICAS IN VITRO EN EL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES.

El cultivo in vitro el desarrollo  y crecimiento de plantas o partes de plantas en condiciones especiales, dentro de recipiente de vidrio. En estas condiciones se le debe sumisnistra a la planta todo lo que necesita para su desarrollo: agua, nutriente, luz y agua. El agua y los nutrientes se aportan con el medio y la luz la reciben a través de las paredes de vidrio.

Es vital  importancia  que  el  medio,  los  frascos,  los  aparatos  y las  semillas  se  mantengan desinfectadas  desde el principio del proceso de germinación.  Cualquier bacteria u hongo que se introduzca en los frascos crecerá  más rápido que las semillas y pronto ocupará su espacio hasta matarlas

El término genérico “cultivo de tejidos vegetales involucra a diferentes técnicas de cultivo de material vegetal diverso, incluyendo a los protoplastos (células desprovistas de su pared celular), lulas, tejidos, órganos y plantas completas. Mediante éstas y otras técnicas de cultivo, es posible obtener plantas libres de microbios en un medio nutritivo aséptico (estéril) en condiciones ambientales controladas. También se lo conoce como “cultivo in vitro de plantas” por realizarse en recipientes de vidrio (hoy también de otros materiales).
Las primeras experiencias relacionadas con el cultivo de tejidos vegetales se remontan a 1902, pero recién en 1922 se logró el primer experimento exitoso: la germinación in vitro de semillas de orquídeas. Luego de la germinación, las plántulas obtenidas se transfirieron a un medio de cultivo en condiciones asépticas, y así se mantuvieron protegidas del ataque de patógenos (hongos, virus y bacterias).
Hoy esta técnica tiene numerosas aplicaciones, algunas de ellas se ilustran en la Figura 1:


      Propagación masiva de plantas, especialmente para especies de difícil propagación por otros métodos, o en vías de extinción.

   Clonación de individuos de características agronómicas muy deseables durante todo el año.

      Obtención de plantas libres de virus.

      Producción de semillas sintéticas.

      Conservación de germoplasma (conjunto de individuos que representan la variabilidad genética de una población vegetal).

      Obtención de metabolitos secundarios.

      Producción de nuevos híbridos.

      Mejora genética de plantas (incluyendo obtención de plantas transgénicas).

      Germinación de semillas.

      Producción de haploides.

      Estudios fisiológicos diversos.





Figura 1. Algunas aplicaciones del cultivo de tejidos en plantas. En la de ariba, micropropagacn de violeta africana a partir de trozos de hojas desinfectados e introducidos en condiciones de  esterilidad. En la de abajo, semillas sintéticas formadas por embriones somáticos obtenidos por  cultivo de células, encapsulados en una matriz inerte (como el alginato de calcio).


Las bases biológicas del cultivo de tejidos: la totipotencialidad celular


La reproducción asexual de plantas por cultivo de tejidos es posible gracias a que, en general, varias células de un individuo vegetal poseen la capacidad necesaria para permitir el crecimiento y el desarrollo de un nuevo individuo completo, sin que medie ningún tipo de fusión de lulas sexuales o gametas. Esta capacidad se denomina totipotencialidad celular, y es característica de un grupo de células vegetales conocidas como células meristeticas, presentes en los distintos órganos de la planta. La potencialidadde una célula diferenciada (una célula de conducción, epidérmica, etc.)

para generar tejidos nuevos y eventualmente un organismo completo, disminuye con el grado de diferenciación alcanzado por esa célula, pero puede revertirse parcial o completamente según las condiciones de cultivo a las que se la someta. Las lulas vegetales crecidas en condiciones asépticas sobre medios de cultivo adicionados con hormonas vegetales, pueden dividirse dando dos tipos de respuesta:
      una desdiferenciación celular acompañada de crecimiento tumoral, que da lugar a una masa de células indiferenciadas denominada callo, la cual bajo las condiciones adecuadas es capaz de generar órganos o embriones somáticos (llamados así porque son estructuras similares a un embrión, pero que no se originaron por unión de gametas),

      una respuesta morfogenética por la cual se forman directamente órganos (organogénesis) o embriones (embriones somáticos).


La primera respuesta se conoce como organogénesis o embriogénesis indirecta (mediada por un estado de callo) mientras que la segunda respuesta se considera organogénesis o embriogénesis directa.

El cultivo in vitro consiste en tomar una porción de una planta (a la que se denomina explanto, como por ej. el ápice, una hoja o segmento de ella, segmento de tallo, meristema, embrión, nudo, semilla, antera, etc.) y colocarla en un medio nutritivo estéril (usualmente gelificado, semisólido) donde se regenerarán una o muchas plantas.
La formulación del medio cambia según se quiera obtener un tejido desdiferenciado (callo), crecer yemas y raíces, u obtener embriones somáticos para producir semillas artificiales.

El éxito en la propagación de una planta dependerá de la posibilidad de expresión de la potencialidad celular total, es decir, que algunas células recuperen su condición meristemática. A tal fin, debe inducirse primero la desdiferenciación y luego la rediferenciación celular. Un proceso de este tipo sucede durante la formación de las raíces adventicias en el enraizamiento de estacas, la formación de yemas adventicias, o cuando se busca la propagación de begonias, violeta africana (ver figura 1) o peperonias mediante porciones de hojas. Uno de los factores más importantes a tener en cuenta para lograr la respuesta morfogenética deseada es la composición del medio de cultivo.

No existen dudas que en todo intento de propagación vegetal, ya sea in vitro o in vivo, el carácter del proceso de diferenciación depende del genoma de la especie, y que está regulado por el balance hormonal propio y por el estado fisiológico del órgano, tejido o lula puesta en cultivo. Sin embargo, también se sabe que ese balance puede ser modificado por el agregado de compuestos que imiten la acción de las hormonas vegetales. Estos compuestos se denominan reguladores del crecimiento, y se emplean en los medios de cultivo para conseguir la micropropagación de una planta.

La totipotencialidad celular es clave en el desarrollo de plantas genéticamente modificadas o transgénicas. Una vez realizada la transformación, ya sea por Agrobacterium o por el método de biobalística, el paso siguiente es el cultivo in vitro, con el fin de obtener, a partir del explanto inicial transformado, plántulas que lleven el transgén en todas sus células (Figura 2).



Figura 2. Cultivo de tejidos y transformación vegetal. En la figura se observan explantos que, luego del proceso de  selección, han perdido coloración y aquellas lulas  transformadas exitosamente que se han desdiferenciado y  rediferenciado para dar origen a un brote



Pasos necesarios para generar plantas a partir de explantos aislados


En  los  protocolos utilizados  durante  el  cultivo  ivitro  se  pueden  distinguir  las  siguientes etapas
(sintetizadas en la Figura 3):

1)   Elección de la planta y/o tejido donante de explantos.

2)   Establecimiento, que consiste en la desinfección de los explantos (generalmente con hipoclorito de sodio) y su posterior adaptación al medio artificial de modo de inducir callo, brote, raíz o embrión somático según se desee.

3)  Multiplicación, para generar una masa vegetal suficiente para la regeneración del mero de plantas necesarias.

4)   Enraizamiento, en la que se busca la formación de raíces con el fin de convertir los brotes o embriones somáticos en plántulas completas.

5)   Rusticación,  que  es  la  aclimatación  de  las  plántulas  obtenidas  in  vitro  a  las  condiciones ambientales ex vitro (suelo o algún sustrato inerte)


El éxito de la técnica depende de muchos factores, entre ellos la edad de la planta (a mayor edad, menor potencial de regeneración), el genotipo y las condiciones ambientales.



Entre las ventajas del cultivo in vitro de material vegetal, se pueden incluir los tiempos más cortos, y la posibilidad de ocupar un espacio mucho más pequeño que si se desea propagar material en tierra.


Figura   3.      Etapas  de   la   regeneración   in  vitro  del  maíz.



Elementos necesarios para el cultivo de tejidos vegetales



 Para llevar adelante este trabajo, se necesitan equipamientos que generen  las condiciones necesarias de esterilidad, como los flujos laminares, que son estaciones de trabajo que hacen circular aire filtrado y estéril, protegiendo así a la muestra con la que se desea trabajar (Figura 4).



Figura   4.  Flujo  laminar  para  el  cultiv de tejidos. Se observa uno de los modelos  de flujo laminar  que  puede   usarse   para  preservar  la esterilidad de  las muestras


Además, se necesita un soporte para el explanto, que puede ser sólido o líquido, y que es conformado por algún agente gelificante inerte (agar, gelrite, etc.), macro  y micronutrientes  esenciales  para la supervivencia de la planta, nutrientes (hidratos de carbono, vitaminas),  agentes reguladores   del crecimiento y hormonas vegetales (ver Tabla 1) que ayudarán a obtener una planta o un órgano en particular, a partir del explanto elegido. Algunos de los elementos  mencionados  pueden  ser  reemplazados por mezclas poco definidas en su composición (jugo de  tomate,  agua  de  coco,  etc.)

 Que  pueden  dar buenos resultados y generalmente resultan más económicas. La acidez de los medios de cultivo para plantas  suele  variar  entre  pH=5  y  6,5.  Luego  se regulan  las condiciones de temperatura  y de fotoperíodo (relación de horas luz y horas oscuridad).

Según sea el balance hormonal y otras condiciones de cultivo, se puede propiciar la regeneración de distintos órganos o formaciones vegetales. Por ej., si el balance de citoquininas/auxinas (ver Tabla 1) es mayor que 1, se favorece la generación de brotes; si es menor que 1, la generación de raíces; y si es igual a 1, la formación de callos.


Tabla 1. Composición de medios de cultivo para células vegetales


Componentes
Características y ejemplos
Agua destilada
Representa el 95% del medio nutriente


Fuente de carbono

Generalmente se usa sacarosa. La fuente de carbono se necesita porque los explantos no son completamente autótrofos, y no pueden cubrir sus necesidades con la fotosíntesis que pueden realizar in vitro

Sustancias inorgánicas
Macroelementos (N, P, K, Ca, Mg, S) y microelementos (Fe, Co, Zn, Ni, B, Al, Mn, Mo, Cu, I), en una proporcn adecuada según la planta elegida.

Vitaminas
Vitaminas B1, B2, B6, vitamina H, vitamina E, ácido fólico, ácido nicotínico, entre otras.



Hormonas y reguladores del crecimiento
Auxinas: promueven la elongación celular, la formación de callos y raíces adventicias, inhiben la formación de brotes axilares adventicios y, a veces, inhiben la embriogénesis.
Citoquininas: promueven la división celular, regulan el crecimiento y el desarrollo de los tejidos vegetales.
Otras: giberelinas, ácido abscísico, etileno.
Mezclas de sustancias poco definidas
Extracto de levadura, extractos vegetales.

Materiales inertes
Se usan como soporte: agar, agarosa, otros polisacáridos, lana de vidrio, papel de filtro, arena.




El cultivo in vitro y la biotecnología:


   



Figura 5. La micropropagación  vegetal.  A partir  de  una  planta   madr se  obtienen numerosos explantos              que,   sujetos  a condiciones y medios de cultivo  adecuados, darán  lugar  a  nuevas  plantas  iguales  a  la planta original, permitiendo su multiplicación.




 La micropropagación


La propagación de plantas in vitro es una técnica muy utilizada en cultivos de importancia económica. Permite cultivar células, tejidos, órganos, semillas, embriones y obtener individuos selectos en forma rápida. Los cultivos son realizados  por  personal  especializado  en  medios específicos (hormonas, minerales, vitaminas, fuente de carbono, agente gelificante, agua, etc.) y condiciones ambientales controladas (temperatura, humedad y luz) (Figura 5). Una vez ajustados los protocolos para la especie o cultivo de interés, es posible automatizar el proceso de modo de llevarlo a mayor escala de producción.
La micropropagación (propagación clonal por cultivo in vitro) constituye uno de los métodos biotecnológicos que mayores logros ha aportado al desarrollo de la agricultura, ya que se la usa en la producción masiva de especies hortícolas, aromáticas, medicinales, frutícolas, ornamentales y forestales

Entre las ventajas de la micropropagación se pueden mencionar:
-     Posibilita incrementar rápidamente nuevos materiales.
-     Permite controlar las condiciones ambientales, debido a su independencia de los mismos (luz, temperatura y humedad controlada).
-     Permite estudiar diversos procesos fisiológicos.
-     Evita el riesgo de contaminación con patógenos, ya que se realiza en medios esterilizados.
-     Se pueden obtener gran cantidad de individuos en espacios reducidos.
-     Permite la obtención de individuos uniformes.
-     Facilita el transporte del material.



El cultivo de meristemas





Figura 6. Cultivo de meristemas. A partir de un meristema aislado se puede obtener una planta  completa. Adaptado de Biotecnología,


En la yema apical se encuentran un grupo de células que conforman el meristema apical (tiene un tamaño entre 0,01 y 0,3 mm), tejido embrionario que tiene la capacidad de formar todos los tejidos de la planta. A partir de ellos se pueden regenerar plantas completas (Figura 6).

El cultivo de meristemas tiene numerosas aplicaciones. Una de las más importantes es la obtención de plantas libres de virus, ya que esta pequeña zona de tejido generalmente no es afectada por estos patógenos vegetales. Otra muy importante es la multiplicación vegetal. La potencialidad de la técnica se demuestra con un ejemplo: a partir de una yema apical, se pueden obtener 4.000.000 de claveles en un año. La técnica permite también multiplicar especies de plantas con reproducción lenta o dificultosa (como las orquídeas), o acelerar la producción de plantas bianuales.

Cultivo de células y órganos vegetales en biorreactores


Una vez obtenidos los callos a partir de algún explanto, los mismos pueden disgregarse para obtener una suspensión de células. Esta suspensión puede utilizarse para generar embriones somáticos (la base  de  las  semillas  sintéticas),  o  puede  directamente  cultivarse  para  producir  metabolitos secundarios, que son compuestos químicos sintetizados por las células vegetales en determinadas condiciones, con gran utilidad para las industrias farmacéutica y alimenticia, entre otras. Por ejemplo, son metabolitos secundarios el mentol y las drogas anticancerígenos vincristina y taxol, y algunos edulcorantes. Los cultivos celulares se llevan a cabo en biorreactores, que son recipientes de distinta capacidad  (de  unos  pocos  a  miles  de  litros),  diseñados  para  propiciar  el  crecimiento  y/o  la multiplicación de distintos tipos de células y/o órganos (Figura 7).


Las raíces vegetales también pueden ser cultivadas en biorreactores, especialmente aquellas transformadas por Agrobacterium rhizogenes, que produce un aumento abrupto en el tamaño y ramificación de la raíz, aumentando así la biomasa, y por ende la cantidad del producto deseado. Un ejemplo de compuesto farmacológico producido por cultivo de raíces es el paclitaxel, o taxol, que es utilizado como anticancerígeno.






Figura 7. Cultivo de lulas y órganos vegetales. A partir de un explanto se pueden establecer  cultivos de células para producir compuestos de interés, o para obtener embriones somáticos y  semillas artificiales, entre otras aplicaciones. Adaptado de “Biotecnología”, UNQ 2006






BIBLIOGRAFIA


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Editorial Continental
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