lunes, 3 de junio de 2013

TAREA # 1 DE LA UNIDAD # 5...

TÉCNICAS  DE SOUTHERN Y NORTHERN.

La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.
Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus obacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.

La PCR 
Sensibilidad: se refiere a la cantidad mínima de ADN necesaria para que se produzca la amplificación, es decir, para obtener una banda. Se relaciona con los falsos negativos, ya que puede que una muestra sea positivas pero sea dada como negativa porque no se ha amplificado por no tener suficiente cantidad de ADN.
Especificidad: se refiere a la obtención de un solo producto amplificado. Viene determinada por los oligos y la especificidad con la que se unen al ADN molde. De esta forma, si los oligos tienen más de un sitio al que se pueden unir aparecerá más de un producto amplificado.
Eficiencia: se refiere a la amplificación máxima que se puede obtener en un número determinado de ciclos.
Fidelidad: se refiere a los errores que comete la ADN polimerasa durante la amplificación. Este concepto es de especial importancia en la secuenciación, pero en otros casos no es tan importante. Una buena fidelidad permite evitar falsos positivos y/o negativos.

 Southern:
 es un método de biología molecular que permite detectar la presencia de una secuencia de ADN en una mezcla compleja de este ácido nucleico. Para ello, emplea la técnica de electroforesis en gel de agarosa con el fin de separar los fragmentos de ADN de acuerdo a su longitud y, después, una transferencia a una membrana en la cual se efectúa la hibridación de la sonda. Su nombre procede del apellido de su inventor, un biólogo inglés llamado Edwin Southern.

Pasos de Southern
1. Extracción del ADN
Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano. Las posibles fuentes de ADN en la escena de un delito incluyen sangre, semen, tejido de una víctima muerta, células del folículo capilar y saliva. El ADN extraído de las pruebas del delito ("indicios" o "vestigios" biológicos) se compara con el extraído de muestras de referencia, obtenidas de personas conocidas,habitualmente de la sangre.
2. Digestión del ADN con una endonucleasa de restricción
El ADN extraído de la muestra se trata con una endonucleasa de restricción,que es una enzima que corta el ADN bicatenario en donde tenga una secuencia característica. La enzima que se usa más frecuentemente para el análisis legal es HaeIII, que corta el ADN en la secuencia 5'-GGCC-3'.
3. Electroforesis en gel de agarosa
Tras la digestión del ADN, los fragmentos de ADN resultantes se separan según su tamaño mediante electroforesis en geles de agarosa. Durante la electroforesis, las moléculas de ADN, que poseen carga negativa, migran hacia el electrodo positivo. Al avanzar las moléculas de ADN, su velocidad de migración se ve reducida por la matriz del gel de agarosa. Las moléculas menores se mueven más deprisa a través de los poros del gel que las de mayor tamaño. Como resultado, se produce una separación continua de los fragmentos de ADN de acuerdo con su tamaño, de modo que los fragmentos más pequeños avanzan la mayor distancia con referencia al origen o punto de aplicación de la muestra.
4. Preparación de un ensayo de Southern ("Southern blot")
Tras la electroforesis, las moléculas de ADN separadas se desnaturalizan mientras permanecen en el gel de agarosa, impregnando éste con una disolución alcalina. Tras la neutralización de ésta, el DNA monocatenario resultante se transfiere a la superficie de una membrana de nailon,realizando así una copia o "calco" (la traducción más literal del inglés blot,conservando este sentido, es "secante"). Este proceso de desnaturalización y transferencia se conoce como método de Southern en recuerdo de quien lo inventó, Edward Southern. Al igual que la aplicación de un secante a un papel con la tinta húmeda transfiere una réplica de la imagen del papel al secante,el "calco" del ADN en el gel a la membrana de nailon conserva la distribución espacial de los fragmentos de ADN conseguida en el gel como resultado de la electroforesis.
5. Hibridación con sonda radioactiva
Una sonda de locus único es una molécula pequeña de ADN o ARN capaz de hibridar (es decir, de formar un dúplex ADN-ADN o ADN-ARN) con el ADN de un fragmento de restricción concreto en el ensayo de Southern. La formación de la molécula dicatenaria (dúplex) depende del emparejamiento de bases complementarias entre las secuencias de la sonda y del ADN presente en el"calco". Las sondas de locus único se marcan habitualmente con un isótopo radiactivo para facilitar su detección, y se eligen para que detecten un locus genético polimórfico en un solo cromosoma humano. El ensayo de Southern resultante de la etapa 4 se incuba en una disolución que contiene una sonda radiactiva de locus único, bajo condiciones de temperatura y concentración desales que favorezcan la hibridación. Tras producirse ésta, se lava el exceso de sonda no unido, de modo que la única radiactividad que quede en la membrana de nailon sea la asociada al ADN del locus diana.
6. Detección de los RFLPs mediante autorradiografía
Las posiciones de hibridación de la sonda radiactiva sobre la membrana del ensayo de Southern se detectan mediante autorradiografía. En esta técnica,la membrana de nailon se coloca, una vez lavada, junto a una película derayos X dentro de una caja que las aísle de la luz. La película registra las posiciones donde hay desintegración radiactiva. Tras su exposición y el revelado fotográfico, el registro resultante de la hibridación de Southern se conoce como autor radiografía
7. Reensayar el resultado del Southern con sondas adicionales
En un análisis legal de DNA se suelen caracterizar polimorfismos de ADN en varios cromosomas diferentes. Tras el revelado de una autor radiografía para la primera sonda, se puede lavar la radiactividad con una disolución a elevada temperatura, que deja el ADN en su sitio, e hibridarlo con una segunda sonda radiactiva que se una a un locus diferente. Se repiten así las etapas 5-7, detectando cada vez un locus diferente. El grupo de autor radiografías de una misma transferencia de Southern se conoce como un "perfil de ADN"

Northern:

Es una técnica de detección de moléculas de ácido ribonucleico (ARN) de una secuencia dada dentro de una mezcla compleja (por ejemplo, un ARN mensajero para un péptido dado en una extracción de ARN total). Para ello, se toma la mezcla de ARN y se somete a una electroforesis en gel a fin de separar los fragmentos en base a su tamaño. Tras esto, se transfiere el contenido del gel, ya resuelto, a una membrana cargada positivamente en la cual se efectúa la hibridación de una sonda molecular marcada radiactiva o químicamente.
El nombre de la técnica deriva de la propia de la detección de ácido desoxirribonucleico (ADN), denominada Southern blot en honor a su descubridor; de este modo, al desarrollarse la técnica equivalente para ARN se empleó el punto cardinal opuesto («northern», septentrional en inglés, frente al meridional «southern»). El northern blot fue desarrollado en 1977 por James Alwine, David Kemp y George Stark en la Universidad de Stanford.

 

Procedimiento 

El procedimiento general comienza con la extracción del RNA total de una muestra de tejido homogenizado. El mRNA se puede aislar a través del uso de cromatografía para mantener solamente los ARN con colas de poli-A. Las muestras de ARN son entonces separadas por electroforesis en gel. Dada la fragilidad de los geles y la incapacidad de las sondas para penetrar en la matriz, las muestras de RNA, separadas por tamaño tras la electroforesis, serán tranferidas a una membrana de Nailon por medio de capilaridad o un sistema de transferencia al vacío.
Una membrana de Nylon cargada positivamente es el soporte más efectivo para usar en el northern blot ya que los ácidos nucleicos, que están cargados negativamente, tienen una alta afinidad por estas membranas.
 El buffer de transferencia usado para el ensayo suele contener formamida, dado que ésta consigue disminuir la temperatura de hibridación de la sonda, lo cual previene la degradación del ARN por las altas temperaturas. Una vez que el ARN ha sido transferido a la membrana, este es inmovilizado a través de enlaces covalentes formados con la membrana, lo cual se consigue por medio de luz ultravioleta o calor.
 Después del marcaje de la sonda, ésta se hibrida con el RNA en la membrana. Las condiciones experimentales que pueden afectar la eficiencia y especificidad de la hibridación están determinadas por las condiciones iónicas, de viscosidad, la presencia de dobles hebras de RNA, bases desemparejadas y composición de las mismas. Finalmente, la membrana debe de lavarse para asegurar que la sonda se ha unido de forma específica y para evitar ruido de fondo en las señales emitidas por la misma.
Estas señales serán detectadas porRayos X y pueden ser cuantificadas mediante técnicas de densitometría. Para crear controles y poder asegurarnos de que no se están mostrando genes que no nos interesen se puede realizar posteriormente la determinación por microarrays o RT-PCR.
Las muestras de RNA son normalmente separadas en geles de agarosa que contienen formaldehído como agente desnaturalizante del RNA para obtener su estructura secundaria.
Los geles pueden ser teñidos con bromuro de etidio y visualizados bajo luz ultravioleta para observar el RNA. Los geles de poliacrilamida con urea también pueden utilizarse, aunque esto suele limitarse a fragmentos de RNA o miRNA, ya que crean un tamaño de poro mas estrecho en su matriz, por lo que el RNA que suele utilizarse no podría desplazarse por el gel.
Suele utilizarse además un patrón de RNA con muestras de tamaño conocido para poder extrapolar el tamaño de las muestras en estudio.

Sondas 

Las sondas del northern blot están compuestas por ácidos nucleicos con una secuencia complementaria a todo o parte del RNA que nos interesa. Pueden ser de DNA, RNA o oligonucleótidos, con un mínimo de 25 bases complementarias para nuestra secuencia diana.
Las sondas de RNA o ribosondas que se transcriben in vitro ayudan a prevenir el ruido de fondo. Normalmente, el DNA complementario se sintetiza con cebadores para la secuencia RNA de interés para actuar como sonda en el Northern blot.
Las sondas requieren ser marcadas bien con isótopos radiactivos (32P) o con quimioluminiscencia, ya sea con fosfatasa alcalina o con peroxidasa de rábano, las cuáles, tras la adición de su sustrato específico producen una emisión de luz detectable.
El marcaje por quimioluminiscencia puede hacerse de dos formas: Por un lado, la sonda puede estar unida a la enzima o bien unida a un ligando (p.ej, biotina) para la cual hay un anticuerpo (avidina o estreptavidina en este caso) está unido a la enzima que revelará el marcaje.
Los Rayos X pueden detectar tanto las señales radioactivas como las quimioluminiscentes, siendo preferida por muchos investigadores la segunda, dada su mayor rapidez, sensibilidad y reducción de los riesgos para la salud que conlleva trabajar con compuestos radioactivos.

Aplicaciones 

El northern Blot permite observar un patrón particular de expresión genética entre tejidos, órganos, estadios del desarrollo, niveles de estrés ambiental, infecciones causadas por patógenos y durante el curso del tratamiento de las mismas. Esta técnica se ha utilizado para mostrar la sobreexpresión de oncogenes y la desregulación de genes supresores tumorales en células cancerosas cuando son comparadas con tejidos normales.
Los patrones de expresión obtenidos nos ayudan a conocer las funciones de los genes. Desde que el RNA se separó por su tamaño, las sondas contra el mismo pueden darnos una idea de su tamaño, sugerir ayuste alternativo, o motivos repetidos en la secuencia. La variación en el tamaño del producto de un gen puede además indicarnos deleciones o errores en el proceso de transcripción. Alterando la sonda podemos conocer la secuencia e incluso determinar que región del RNA ha sido delecionada.

Ventajas y Desventajas 

El análisis de la expresión génica puede realizarse por diversos métodos, como RT-PCR, Ensaños de protección de RNasa, microarrays, Análisis seriado de expresión génica así como el Northern Blot. Los microarrays son los mas utilizados y son generalmente consistentes con los datos obtenidos por el Northern Blot. No obstante, en ocasiones el Northern Blot es capaz de detectar pequeños cambios en la expresión de genes que los microarrays no pueden identificar.
Ventajas adicionales de usar el método de Northern Blot incluyen la habilidad de definir el tamaño de la cadena de ARN, la habilidad de observar los productos del empalme alternativo, la posibilidad de usar sondas con homología parcial, la habilidad de medir el tamaño y la calidad del ARN antes de realizar la inmovilización en la membrana y finalmente la opción de guardar la membrana para ser analizada en repetidas ocasiones en el futuro.
Un problema común del northern blot es que la degradación de la muestra por RNAsas (endógenas de la muestra o a través de contaminación ambiental) que puede ser evitada por una apropiada esterilización de los materiales así como el uso de inhibidores de RNAsas como el dietilpirocarbonato

 Northern Blot reverso 

Una versión alternativa del método es conocidad como Northern Blot reverso. En ésta, el ácido nucleico que actua como sustrato (fijo en la membrana) está conformado por fragmentos aislados de ADN, mientras que la sonda está conformada por ARN obtenido de los tejidos y etiquetada con material radioactivo.
Esta variante es más compatible con el uso de un chip de ADN, que se ha convertido en practica común en la parte final de la década de 1990 y la primera del siglo XXI. Ambas prácticas requieren la fijación de fragmentos de ADN como su hibridación con sondas de ARN celular. De esta manera el proceso en reverso, aunque inicialmente era poco común, permitió que el Northern Blot evolucionara hasta tener un lugar en el desarrollo de los perfiles de expresión génica.

CONCLUSIÓN GENERAL

Southern 

El método tipo Southern o Southern blot fue desarrollado para la detección de genes específicos en el ADN celular.
El ADN es digerido con una enzima de restricción y los fragmentos son separados por tamaños mediante electroforesis en un gel. A continuación los fragmentos de ADN de doble cadena son desnaturalizados mediante un proceso químico separando las dos hebras componentes del ADN en sus cadenas sencillas. Posteriormente, el ADN inserto en el gel es transferido a un filtro de nitrocelulosa, con lo que en el filtro queda representada una réplica de la disposición de los fragmentos de ADN presentes en el gel. A continuación el filtro se incuba durante un tiempo con la sonda marcada (radiactivamente o con un fluorocromo); durante la incubación la sonda se va hibridando con las moléculas de ADN de cadena sencilla de secuencia complementaria (o muy parecida). La sonda unida al fragmento de ADN complementario se puede visualizar en el filtro de una forma sencilla mediante una exposición a una película de rayos X para el caso de sondas radiactivas o con una película sensible a la luz, para el caso de sondas con fluorocromo

Northern 

El segundo método, tipo Northern blot o Northern, se utiliza para identificar las cadenas de ARN de secuencia semejante al ADN que se usa como sonda; a diferencia del tipo Southern que se utiliza para identificar ADN, el método Northern sirve para identificar ARN.

El ARN se extrae y se fracciona en tamaños variables mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida en unas condiciones que mantengan las cadenas de ARN en estado desnaturalizado. El proceso continúa de forma semejante a la hibridación de tipo Southern. El método del Northern se utiliza muy frecuentemente para realizar estudios de expresión génica; para conocer qué genes están activos formando ARN mensajero en qué condiciones, en qué tejidos o tipos celulares.