INSTITUTO
TECNOLOGICO DE CD ALTAMIRANO.
LICENCIATURA EN
BIOLOGIA QUINTO SEMESTRE.
QUE PRESENTA:
CANDIDO TORRES
SANTIBAÑEZ.
CON # DE CONTROL:
09930058.
PROFESOR: FRANCISCO
JAVIER PUCHE ACOSTA.
ASIGNATURA:
BIOLOGIA MOLECULAR.
JUNIO/2012.
10.1 Métodos de purificación y análisis de los ácidos
nucleicos.
10.2 Técnicas de hibridación.
10.3 Técnicas de clonación de genes.
10.4 Prueba de PCR en el diagnostico de enfermedades
10.5 Genéticas
10.6 Por microorganismos (bacterianas, protozoarios, entre
otros)
10.7 Tecnología del ADN recombinante.
INTRODUCCIÓN.
TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR
Las técnicas de biología molecular están basadas en la asociación de alteraciones de los ácidos nucleicos con el cáncer.
Las células tumorales se caracterizan por presentar alteraciones genéticas y epigenéticas. Las mutaciones somáticas puntuales en oncogenes o genes supresores del tumor son frecuentes, observándose anormalidades cromosómicas como reordenamientos, delecciones, amplificaciones y aneuploidías. Son señales de inestabilidad genómica y son características del fenotipo maligno. Estas alteraciones son utilizadas como marcadores moleculares para poder detectar las células tumorales en las muestras clínicas.
La mayor ventaja de estos ensayos es la gran estabilidad de la molécula de DNA, si lo comparamos con la de las proteínas o RNA, ya que la pérdida de sensibilidad debida a la degradación enzimática durante el almacenamiento o transporte de las muestras clínicas es menos crítica en este tipo de estudio (Jeannine et al., 2001).
¿A qué se denominan
técnicas de biología molecular?
En principio se denomina así a todas las técnicas de laboratorio
que se usan para aislar ADN o extraerlo en alta pureza, visualizarlo para ver
su estado, cortarlo y pegarlo (nacimiento de la Ingeniería genética),
amplificar una región en una enorme cantidad de moléculas (clonación de
fragmentos en bacterias u otros vectores como virus y PCR), corte de una
determinada región con enzimas de restricción para ver si por una mutación se
gana o se pierde un sitio de restricción (análisis de mutaciones por RFLP o
Restriction fragment lengt polymorphism), que siginifica: diferencias en los
tamaños de los fragmentos de restricción debido a polimorfismos en el ADN entre
otras.
Todas estas técnicas tiene
diversas aplicaciones generalmente en el diagnóstico de enfermedades
hereditarias, búsqueda de alelos mas o menos frecuentes asociados a una
característica que nos interesa seleccionar, diagnóstico de contaminación
bacteriana en alimentos (detección de Escherichi coli 0257, cepas difrenctes de
Salmonellas, Mycobacterium sp) diagnóstico viral o de infección viral (HIV,
Hpatitis C, PIF, otros), selección de marcadores moleculares para asistir en el
mejoramiento genético de una especie, test de paternidad, diganóstico de
identidad forense, etc.
La primera técnica que todas las
demás necesitan es la extracción del ADN, y para ello es necesario purificarlo
desde cualquier tejido aunque usualmente se hace a partir de sangre. Se basa en
una serie de lavados de la muestra y agregado de proteinasas que eliminan las
proteínas del medio, detergentes para elminar las membranas plasmáticas y luego
ir purificando el ADN de esa mezcla de ARN proteínas y restos celulares.
¿Como visualizamos el ADN?
Para poder visualizar el ADN
debemos recurrir a los geles de Agarosa. Una vez extraído el ADN o hecha una
reacción de PCR debemos verificar que el ADN está allí.
Para eso debemos prepar un gel de
agarosa, con una serie de pocillos donde colocar las muestras que sumergidas en
el gel y este en un buffer conductor, como el ADN tiene carga negativa migrará
hacia el polo positivo si le hacemos pasar una corriente eléctrica.
La Genética molecular aparece
desde el descubrimiento de la doble hélice de ADN de Watson y Crick en 1954.
Luego Francis Crick continúa con el descubrimiento del código genético en los
60’s. Es decir se descubrió que las bases del ADN se leen de a 3, y tres
combinaciones de letras significan un aminoácido que formará parte de una
proteína. Allí comienza a comprenderse como es la molécula de ADN y como lleva
la información que contiene a la célula que la contiene. A esto se lo denominó
“Dogma central de la biología molecular”.
Luego aparece el
descubrimiento de las enzimas de restricción que permiten cortar el ADN y así
analizarlo. Nace allí la ingeniería genética. Eso permitió cortar y pegar a la
molécula de ADN para estudiarla, analizar patologías en ciertos genes, etc.
Hasta que, hacia fines de los 80’s, Karl Mullis descubre la técnica de PCR que
revolucionó a la genética por su paracticidad y rapidez para amplificar una
region de ADN en cantidad suficiente para luego hacer todo tipo de análisis.
La secuenciación fue descubierta
por Sanger
Gracias a este descubrimiento
fueron posibles el uso de muchas técnicas para realizar tanto la secuenciación
completa del genoma humano como el de muchos animales domésticos y ademas usar
la secuenciación que hoy en día es automática y realizada por un secuenciador
en múltiples aplicaciones.
Una de las aplicaciones de los
secuenciadores es el fingerprinting o huellas de DNA que permite tanto la
realización de test de paternidad como identificación de criminales. En las
primeras epocas esta técnica de huellas de ADN descubierta por Sir Alec
Jeffries y se realizaba por Southern blot, en honor a su descubridor llamado de
apellido Southern, pero hoy en día se realiza por PCR.
La primera técnica utilizada para
la identificación de fragmentos de ADN fue el Southern blot. Se transfiere al
ADN de un gel de agarosa a una membrana donde se hibridiza con una sonda
marcada radioactivamente. Luego llegaron el north ten y el western para
detectar fragmentos de ARN proteínas respectivamente.
Aplicaciones de las técnicas
Son inmumerables las aplicaciones
de estas técnicas y quizás las más usadas hoy en dia, son la PCR seguida de una
restricción con enzimas y detección de los fragmentos en un gel o seguidas de
un gel de poliacrilamida que tiene más definición para la separación de
fragmentos de pocas bases de diferencias. Cuando se usa PCR y enzimas de
restricción se denominan PCR/RFLP (derivado de variación en la longitud de los
fragmentos de restricción en ingles).
Esta técnica puede usarse entre
otras cosas para detección de alelos de un gen normales y mutados (enfermedades
hereditarias) o para distinguir cepas bacterianas o virales o alelos más
favorables para una característica de interés productivo para luego aplicarlo a
la selección.
METODOLOGIA.
La metodología que se utiliza son los pasos a seguir
para la manifestación y desenlace de la unidad # 10 y con sus
correspondientes subtemas: realizando enlaces de acuerdo a lo manifestado
en clases de la unidad por el maestro y hacer conclusiones a lo entendido al
final de la unidad de todos los subtemas, publicando lo más interesante yde
cada tema visto en clase. y trabajos o ensayos obtenidos correspondiente a cada
clase.
EVIDENCIAS.
UNIDAD 10 TÉCNICAS DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR
10.1 MÉTODOS DE PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS.
OBTENCIÓN
DE ADN Y SEPARACIÓN DE FRAGMENTOS DE ADN.
A un
laboratorio de Biología Molecular llegan
distintos tipos de muestras, cada una con sus peculiaridades a la hora
de analizar y obtener su ADN. “A priori” se plantean dos situaciones
diferentes. Si lo que se pretende es conocer la ubicación física del ADN/ARN de
interés en un corte histológico se
deberá proceder a estudios “in situ”,
mientras que si no es necesario conocer dicha ubicación será suficiente con
obtener el ADN celular en solución. El ADN en solución es una mezcla de ADN mitocondrial, nuclear
eucariota y viral/bacteriano si estuvieran presentes en la muestra virus/bacterias.
Centrándose
en la obtención de ADN en solución existen diferentes métodos de lisis: lisis
diferencial, lisis neutra... Una vez realizada la lisis, la solución de ADN
obtenida no siempre es apta para utilizar en las reacciones posteriores de
amplificación, restricción, marcaje o secuenciación, por lo que es conveniente
por un lado separar el ADN del resto de macromoléculas que lo acompañan,
preferentemente proteínas, proceso que suele realizarse con ayuda de solventes orgánicos (fenol y cloroformo) y, por otro
separar el ADN de aquellas moléculas de pequeño tamaño con actividad inhibidora
presentes en la solución de ADN. El ADN una vez limpio de proteínas y/o
pequeñas moléculas puede ser utilizado directamente, si bien en la mayoría de
las situaciones es necesario concentrarlo mediante ultrafiltración o
precipitación con alcohol.
El
sistema de valoración de la concentración de ADN será función de cuales han
sido los tratamientos y, por tanto, del grado de pureza del ADN obtenido.
Pueden emplearse desde métodos altamente sensibles y exactos como la
espectrofotometría y fluorometría, hasta métodos aproximativos, tales como la comparación del grado de fluorescencia respecto a un
control de concentración conocida.
Una vez conocida la
concentración del ADN, éste será utilizado básicamente con el propósito de
amplificar determinadas secuencias del mismo mediante PCR.
En ciertos casos la
simple detección del fragmento amplificado tiene valor diagnóstico por sí
mismo. La metodología empleada para la detección puede ser:
1.
separación y visualización de dicho fragmento en geles adecuados de agarosa o
poliacrilamida (Ej. detección de infección por virus de la hepatitis, SIDA, HPV
oncogénicos...). En otros casos el valor diagnóstico se obtiene por comparación
de la movilidad del fragmento en un gel, respecto a un fragmento de
características conocidas (Ej. movilidad de un exon mutado del gen supresor p53
en relación al mismo exon normal...), o bien,
2.
detección del fragmento amplificado mediante ELISA con revelado colorimétrico o
quimioluminiscente.
Por el contrario,
en otros casos el valor diagnóstico se alcanza una vez que el fragmento
amplificado se analiza mediante cualquiera de las siguientes técnicas:
1.
Corte con enzimas de restricción. Los fragmentos generados en la restricción se
separan en geles de agarosa o poliacrilamida adecuados (Ej. Tipificación HPV,
genotipado ApoE...).
2.
Hibridación. Los fragmentos generados en
el PCR se separan en gel de agarosa, se
transfieren a un soporte adecuado (nitrocelulosa, nylon), y finalmente se
hibridan con un ADN sonda marcado (Ej. Tipificación de los genes HLA Clase
II...).
3.
Secuenciación. Los fragmentos generados
durante la reacción de secuenciación se separan en geles desnaturalizantes de
poliacrilamida (Ej. Secuenciación de genes mitocondriales mutados implicados en
ciertas enfermedades).
10.2 TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN
LA HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Es un
proceso de unión de dos hebras complementarias de ácidos nucleicos pero cuyo
origen es distinto. Una de ellas será el ácido nucleico diana y la otra será la
sonda empleada para localizar ese ácido nucleico diana.
formato de hibridacion
Técnicas de hibridación
Hibridación
in situ con filtro (HISF).
Este método tampoco precisa de extracción de ADN y analiza muestras obtenidas
por raspado o con torunda o cepillo. Las células se aplican directamente sobre
un filtro el cual se trata con sustancias alcalinas para la lisis celular y la
desnaturalización del ADN. El método HISF es de muy fácil ejecución, rápido y
barato es ,sin embargo, poco específico y, a menudo, resulta difícil separar
las señales positivas del fondo. Su uso se limita a trabajos con gran
cantidad de especímenes.
Hibridación Southern blot (SB).
Necesita de la extracción del ADN de la muestra con fenol/cloroformo y de la
eliminación de ARN y proteinas de la misma por digestión enzimática. Con la
aplicación de endonucleasas de restricción-la enzima Pst I es la mas utilizada,
pues corta los genomas de HPVs en fragmentos de diferentes tamaños ofreciendo
un patrón característico en el gel de agarosa-el ADN se rompe, realizándose una
separación electroforética de los fragmentos en gel de agarosa los cuales
pueden ser visualizados con bromuro de etidio. El ADN se desnaturaliza y se
transfiere a una membrana realizándose una hibridación.
El SB es el método de
referencia actual para el tipaje de HPVs. La especificidad de esta técnica es
superior a cualquier otra debido a la purificación extra del ADN por
electroforesis. Además es el único método que permite conocer si el genoma
viral está en situación episomal o integrado en el ADN celular. Las desventajas
fundamentales del SB son su gran complejidad técnica, duración de la misma y la
necesidad de utilizar tejidos no fijados, puesto que existen protocolos para
material fijado, su sensibilidad se reduce muy notablemente.
El
blot invertido (BI) es una
variante del SB. El ADN celular es marcado e hibridado con con diferentes
DNA-HPVs, previamente digeridos y dispuestos en un filtro. El BI requiere una
reacción individual para cada especímen, de sensibilidad inferior al SB
(detecta 10 copias HPV/célula), se suele utilizar para tipar muchos genotipos
en un espécimen.
El
dot/spot blot (DB) consiste en la extracción del ADN celular total y en
su desnaturalización, después se fija a una membrana por medio de presión
negativa en un aparato manifold. También se puede realizar la desnaturalización
en la misma membrana. Una vez realizada la hibridación se produce la
autorradigrafía, si se emplearon sondas calientes o el revelado enzimático, si
se utilizaron frías. Con el DB se pueden analizar de una vez mas de 100
especímenes mientras que el SB no admite mas de 15.
Uno de los problemas mas
importantes del DB es el "fondo" provocado por las hibridaciones
inespecíficas. Este problema se puede minimizar con el uso de sondas de ARN ya
que los híbridos ARN-ADN tienen una Tm superior a los ADN-ADN y las
hibridaciones inespecíficas pueden eliminarse con la aplicación de ARNasa
(2).
La
hibridación sandwich (HS) no
necesita extracción del ADN. Esta técnica utiliza una sonda con dos fragmentos
separados, cada uno con una región complementaria con el ácido nucléico diana.
Un fragmento se une al filtro y fija la secuencia específica de HPV al mismo.
El segundo de los fragmentos está marcado y se fija al híbrido anclado en la
membrana permitiendo su detección.La HS es un método con una especificidad
estimada en 1-5 X 105 moléculas de ADN HPV (1 a 5 veces mas que el
DB) y muy sensible (3 veces el DB).La HS tiene varios inconvenientes, por una
parte solo un tipo de HPV puede ser analizado por muestra, además, para obtener
buenos resultados se necesita un volumen importante de muestra, superior a 5 X
105 (3).
La
hibridación Northern se utiliza para la detcción de RNA de HPVs. El ARN celular se extrae y se separa
por medio de un gel desnaturalizante que contiene formaldehido. Seguidamente se
hibridan con sondas ARN antisense o ADN.
En
todos los sistemas de hibridación descritos anteriormente el ácido nucléico
diana está localizado en un soporte sólido, bien una membrana o una biopsia o
extendido citológico, en los procedimientos que seguidamente describiremos el
ácido nucleico se encuentra disuelto en un líquido.
Detalle de la
tecnica de Southern
Esta técnica fue descrita por el
Dr. Southern en 1975 y constituye el método más utilizado para analizar la
estructura del ADN cortado por enzimas de restricción. Para la realización de
esta técnica se debe extraer ADN genómico de linfocitos de sangre periférica
para conocer el genotipo normal del individuo y ADN del tejido tumoral.
Con una
muestra de 10 cm3 de sangre se pueden extraer de 200 a 300
nanogramos de ADN con lo que se pueden realizar de 20 a 30
"digestiones" con enzimas de restricción.
Después de dicha digestión, el
aproximadamente millón de fragmentos de ADN obtenidos, se separan entre sí,
según su tamaño , en un gel de agarosa, sometido a un campo de corriente
continua en una cubeta de electroforesis. El ADN posee una carga eléctrica
negativa por lo que se desplaza hacia el polo positivo. Los fragmentos más
pequeños se desplazan a mayor velocidad que los más grandes (Fig.).
Con el electroforesis convencional
se separan fragmentos entre 100 y 30.000 pares de bases. Cuando se marca con un
colorante fluorescente (bromuro de etidio), el ADN separado de esta forma,
aparece como una mancha homogénea de material fluorescente debido a que existen
demasiados fragmentos de ADN como para que puedan diferenciarse entre sí.
Representación esquemática de la
técnica de Southern Blotting para el estudio de las secuencias específicas en
el ADN genómico.
La técnica de Southern Blotting
permite identificar uno o dos fragmentos de ADN de interés en el aparentemente
uniforme colección de millón de fragmentos cortados con la enzima de
restricción. El siguiente paso consiste en la desnaturalización de los
fragmentos de cadena doble para obtener fragmentos de cadena única. Esto se
logra con un bufer de Ph básico.
La molécula de cadena única es transferida
desde el gel a una membrana de nilón o a papel de nitrocelulosa, ayudado por
capilaridad.
La identificación de uno o más fragmentos de interés
se logra con una sonda específica marcada con radioactividad o colorimetría. La
sonda marcada se incuba con el filtro de nilón o nitrocelulosa en una solución
que favorece la formación de ADN de doble cadena. Después de lavar el filtro,
para retirar la sonda que no se unió a su cadena complementaria, el filtro se
expone a un film de Rx durante 24 a 48 horas, para observar la posición de uno
o más fragmentos a los que la sonda ha hibridizado, lo que se observa como una
banda negra después del revelado.
10.3 TÉCNICAS DE CLONACIÓN DE GENES.
Consiste en la obtención de un
gran número de fragmentos idénticos a partir de uno original. Para ello se
aísla primero el fragmento de DNA que se quiere clonar, se liga a un
transportador o vector (plásmidos, fagos , cósmidos etc..) que tras
introducirlo dentro de una célula va a permitir su replicación por cultivo. Una
vez replicado considerablemente se recupera junto con el vector correspondiente
y posteriormente se le separa del vector, obteniendo como resultado un gran
número de copias del fragmento de interés.
10.4 PRUEBAS DE PCR EN EL DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES GENÉTICAS POR MICROORGANISMOS / bacterias,protozoarios, entre otros).
Las aplicaciones actuales de la
biología molecular para el diagnóstico clínico son muy variadas:
Genética
- Diagnóstico prenatal
- Tipaje de HLA
- Reordenamientos genéticos
- Detección de esperma aneuploide
- Creación de mapas genéticos
Diagnóstico Microbiológico
· Diagnóstico rápido de infecciones
víricas
· Detección de microorganismos en células
infectadas/transformadas
· Determinación de la relación génetica
entre varios tipos de microorganismos similares
· Correlacionar la presencia/expresión de
agentes virales/infecciosos en tejidos
neoplásicos.
· Determinar la resistencia a los
antibióticos de las bacterias.
· Epidemiología de las infecciones
· Detectar y cuantificar microorganismos
difíciles de cultivar o para los que no existen
reactivos serológicos.
· Detectar regiones transformantes
específicas en virus
Diagnóstico y clasificación de
neoplasias y establecimiento de un pronóstico
· Detectar reordenamientos de genes
· Detectar reordenamientos en tumores
humanos con anomalías consistentes cariotípicas
· Detectar reordenamientos
moleculares/anomalías de expresión genética en ausencia de alteraciones del
cariotipo
· Estudio de la estructura/expresión de
oncogenes
· Detección de amplificación
genética/resistencia a drogas
· Diagnóstico de cell lineage en base a
la expresión genética
APLICACIONES PCR
La extraordinaria sensibilidad de
la técnica de PCR, que permite detectar una copia viral en un millón de células
es un arma de gran valor en la detección de infecciones HPV, especialmente en
aquellas con un bajo número de copias víricas, como es el caso de la infección
oculta. El problema mas importante de las técnicas de amplificación genómica es
la contaminación de la reacción con ADNs extraños, en cualquiera de sus fases,
produciendo resultados falsamente positivos.
La adopción de medidas, como el
uso de pipetas de desplazamiento vertical, de separación de especímenes y
reactivos o de "primers" anticontaminación permiten la obtención de
resultados fiables. Otra desventaja de la reacción de PCR es la no
amplificación de genomas cuando no existen "primers" específicos, con
la imposibilidad de detectar nuevos tipos de HPVs.
La técnica PCR in situ adapta la
tecnología habitual de la PCR a un corte histológico. Se puede utilizar un
termociclador convencional con alguno "trucos" (3), o bien recurrir a
un termociclador específico para PRC in situ
10.5 TECNOLOGÍA DEL
ADN RECOMBINANTE
INTRODUCCIÓN
Uno de los más grandes avances de la ciencia contemporánea ha sido el desarrollo de la ingeniería genética y la biotecnología. Por medio de estas dos disciplinas –muy relacionadas entre sí– se ha logrado manipular genéticamente a los individuos con el fin de propiciarles nuevas características.
La tecnología del DNA recombínate es una técnica que ha
permitido introducir material genético foráneo en un individuo, y hacer que
éste organismo incorpore dicho material a su genoma y lo exprese como si fuera
suyo. Esta tecnología desarrolló a partir del descubrimiento de las enzimas de
y su acción sobre los ácidos nucleicos. Cuando se complementó el estudio de las
enzimas de restricción con la micromanipulación (conjunto de técnicas que
permiten inyectar y succionar porciones de una célula) se desarrolló esta nueva
tecnología, que ha abierto las puertas a un nuevo y amplio campo de acción a la
genética molecular.
El principio de la tecnología de DNA recombínate se basa en
la inserción de un fragmento de DNA foráneo en un hospedero de clonaje
molecular por medio de un vector de
clonaje, como ser un virus o un plásmido. Una vez que el fragmento de DNA
foráneo se ha introducido en el hospedero, comienza el proceso de clonaje
molecular y la recombinación, dando como resultado la expresión del gen o los
genes introducidos en un organismo diferente.
En la actualidad existe una gran cantidad de aplicaciones de la tecnología de DNA recombinante a todo nivel. Se aplica esta técnica para la producción de vacunas, para la producción de proteínas, aminoácidos, vitaminas y ribonucleótidos y la producción de curas genéticas para algunas enfermedades, en el campo médico.
En la actualidad existe una gran cantidad de aplicaciones de la tecnología de DNA recombinante a todo nivel. Se aplica esta técnica para la producción de vacunas, para la producción de proteínas, aminoácidos, vitaminas y ribonucleótidos y la producción de curas genéticas para algunas enfermedades, en el campo médico.
La ingeniería
genética en plantas también ha provisto la mejora de ciertas especies
haciéndolas más resistentes o introduciendo ciertas características de otros
individuos para mejorarlas.
Otra aplicación de la tecnología de DNA recombinante bastante reciente, es la producción de microorganismos transgénicos para procesos de bioremediación de hidrocarburos, metales pesados como el mercurio. Las técnicas de bioremediación permiten una descontaminación de ambientes afectados por medio del uso de microorganismos capaces de degradar ciertas sustancias, en muchos casos se han empleado organismos nativos del lugar pero también se ha trabajado con numerosas cepas modificadas genéticamente para amplificar su acción sobre los contaminantes.
Otra aplicación de la tecnología de DNA recombinante bastante reciente, es la producción de microorganismos transgénicos para procesos de bioremediación de hidrocarburos, metales pesados como el mercurio. Las técnicas de bioremediación permiten una descontaminación de ambientes afectados por medio del uso de microorganismos capaces de degradar ciertas sustancias, en muchos casos se han empleado organismos nativos del lugar pero también se ha trabajado con numerosas cepas modificadas genéticamente para amplificar su acción sobre los contaminantes.
Enzimas de
restricción: producción de fragmentos de DNA para recombinación
Las enzimas de restricción o endonucleasas de restricción fueron descubiertas por Werner Aber, Hamilton Smith y Daniel Nathans. Estas son enzimas sumamente específicas que catalizan la hidrólisis de los enlaces fosfodiéster de los ácidos nucleicos y son capaces de cortar ambas hebras del DNA en lugares específicos, creando de esta manera una serie de fragmentos. Se ha visto que ciertas cepas de E. coli degradan (cortan) el DNA de ciertos virus fagos infectivos, a menos que los ácidos nucleicos presenten metilación (adición de grupos metilo) en algunos residuos de adenina o citosina del sitio de corte.
Tabla. Algunas de las principales enzimas de restricción conocidas y su
origen (en base a Griffiths et al. 1998).
Enzima de restricción
|
Organismo de donde se extrae
|
EcoRI
|
Escherichia coli
|
EcoRII
|
Escherichia coli
|
HindII
|
Haemophilus influenzae
|
HindII
|
Haemophilus
influenzae
|
HaeIII
|
Haemophilus
aegyptius
|
HpaII
|
Haemophilus
parainfluenzae
|
PstI
|
Providencia stuartii
|
Mayi
|
Serratia marcesens
|
BamI
|
Bacillus
amyloliquefaciens
|
BglII
|
Bacillus globiggi
|
Las enzimas de
restricción trabajan únicamente sobre secuencias específicas de bases
nitrogenadas, el lugar donde se produce el corte se denomina sitio de
restricción y producen dos tipos de corte:
(1) corte con extremos cohesivos y
(2) corte con extremos romos (ver Fig. ) (Griffiths et
al. 1998).
Producción de extremos (a) cohesivos y (b)
romos, por medio de enzimas de restricción en hebras de DNA.
Otro método para producir fragmentos pequeños de DNA para recombinación consiste en emplear ultrasonidos. Los ultrasonidos son capaces de romper al DNA cromosomal en pequeños fragmentos. A pesar de ser un procedimiento muy sencillo, tiene la desventaja de producir fragmentos aleatorios y no permite aislar genes con gran precisión (Mateos 2000), sin embargo son empleados por su facilidad de uso.
Algunas enzimas de restricción como EcoRV encuentran el sitio de restricción, por medio de un barrido a lo largo del surco mayor del DNA y reconocen una secuencia palindrómica de seis nucleótidos de longitud, en la que se presenta una simetría rotacional binaria. Cuando la enzima de restricción encuentra el sitio de corte, se producen una serie de reordenamientos estructurales en el DNA y se produce un ajuste inducido en el cual el DNA sufre una torsión de 50 grados. En este proceso se va haciendo un barrido muy rápido sobre la hebra de DNA, leyendo grupos de seis nucleótidos, hasta encontrar la secuencia diana. Esto comprueba el carácter altamente específico de las enzimas de restricción.
Los puntos de corte de las enzimas de restricción pueden ser empleados como marcadores para la elaboración de mapas de restricción. Para elaborar un mapa de restricción, se tiñen los fragmentos resultantes de la lisis y se los separa mediante una electroforesis PAGE (Electroforesis en gel de poliacrilamida) y se establecen las distancias de migración, siendo los resultados muy específicos para cada molécula de DNA en estudio.
Los extremos cohesivos son los más empleados en la
construcción de DNA recombinante, puesto que al tener una porción lineal
"pegajosa" es más sencillo que se produzca la unión con el DNA del
hospedero, por complementación de bases, dicha unión se produce por la
intervención de enzimas denominadas ligasas. Adicionalmente, la enzima
transferasa terminal puede ser usada para generar extremos cohesivos en un
fragmento de DNA. A pesar de ser más difícil, también es posible realizar
uniones de extremos romos, mediante la adición de conectores sintéticos de DNA
que actúan a manera de extremos cohesivos (como el caso de la transferasa
terminal), sin embargo este procedimiento no es de mucha utilidad para realizar
una clonación directa de DNA.
Existe otro tipo de enzimas de restricción de doble función, denominadas endo–exonucleasas, las cuales son capaces tanto de añadir nucleótidos como de removerlos de una hebra de DNA. Estas enzimas también son muy específicas y reconocen secuencias exactas, plantea que las enzimas de restricción del tipo endo–exonucleasas pueden tener un papel fundamental en la reparación del DNA y/o en la muerte de células defectuosas, gracias a la especificidad de la enzima. Se han hecho numerosos experimentos con endo–exonucleasas aisladas de E. coli, Neurospora crassa, Aspergillus nidulans, mitocondrias de Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, células de mono y células leucémicas de humano.
MÉTODO
Inserción de los fragmentos de ADN.
Esta inserción se realiza en vectores de clonado, que son los agentes
transportadores capaces de introducirlos en las células hospedadoras. Los vectores de clonación son pequeñas moléculas de ADN, que tienen capacidad
para autorreplicarse dentro de las células hospedadoras.
Se utilizan con frecuencia dos tipos de vectores de clonación: plásmidos y
virus. de introducirlos en las células hospedadoras.
Plásmidos. Son moléculas de ADN circular,
con un tamaño menor que el del cromosoma. Se replican con independencia del
cromosoma bacteriano ya que tienen su propio origen de replicación.
Métodos de introducción del vector.
El siguiente paso será introducir el vector de clonación que contiene el gen
que se quiere clonar en la célula hospedadora, para que ésta, al multiplicarse,
origine un clon celular que lleve el gen concreto.
Existen varios métodos que
dependerán del tipo de célula fundamentalmente.
En bacterias (células procariotas), mediante estos procesos:
En bacterias (células procariotas), mediante estos procesos:
-Transformación. Ocurre
espontáneamente en ciertos tipos de bacterias y se consigue artificialmente
sometiendo a la célula bacteriana a tratamientos físicos y químicos.
La célula capta moléculas de ADN que se encuentran en el medio externo, las
introduce en su interior y las incorpora a su genoma.
-Transducción. Este método consiste en introducir el ADN en
la célula hospedadora mediante un virus, utilizando como vector de clonación el
genoma del virus.
En la siguiente figura puede verse el proceso en tres etapas. El número 1 corresponde al virus aproximándose a una bacteria. Se puede observar como lleva un genoma ya con el gen que interesa clonar. El siguiente momento 2, corresponde al contacto entre el virus y la pared bacteriana, en cuya zona de contacto se produce un poro por donde como vemos en la etapa 3, el virus inyecta su ADN al interior de la célula bacteriana.
En la siguiente figura puede verse el proceso en tres etapas. El número 1 corresponde al virus aproximándose a una bacteria. Se puede observar como lleva un genoma ya con el gen que interesa clonar. El siguiente momento 2, corresponde al contacto entre el virus y la pared bacteriana, en cuya zona de contacto se produce un poro por donde como vemos en la etapa 3, el virus inyecta su ADN al interior de la célula bacteriana.
Selección de celulas recombinanates.
Además del origen de
replicación, los vectores de clonación deben llevar otros genes
denominados marcadores, que sirven para identificar las células
que contienen el vector de clonación. Se suelen utilizar como marcadores, genes
de resistencia a antibióticos y genes de bioluminiscencia.
Genes de resistencia a antibióticos. Sirven para
identificar bacterias que contienen el vector de clonación, porque estas
bacterias serán resistentes al antibiótico del gen marcador.
Genes de luminiscencia.. En este caso, la célula que
contenga el gen que se quiere clonar, tendrá la propiedad de emitir luz, ya que
el marcador que se le incorpora determina que se exprese esa característica.
Este sistema se emplea cuando la célula hospedadora es una célula eucariota.
Esquema general:
CONCLUSIÓN
el profesor cumplio con los objetivos anexados de todas las unidades , todo marcho bien de todo a todo en este curso.
BIBLIOGRAFIA
