RESUMEN DE LA
UNIDAD # 3…° TÉCNICAS IN VITRO EN EL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES.
El
cultivo in vitro el desarrollo y crecimiento
de plantas o partes de plantas en condiciones especiales, dentro de recipiente
de vidrio. En estas condiciones se le debe sumisnistra a la planta todo lo que
necesita para su desarrollo: agua, nutriente, luz y agua. El agua y los
nutrientes se aportan con el medio y la luz la reciben a través de las paredes
de vidrio.
Es vital
importancia que el
medio, los frascos,
los aparatos y las
semillas se mantengan desinfectadas desde el principio del proceso de
germinación. Cualquier bacteria u hongo
que se introduzca en los frascos crecerá
más rápido que las semillas y pronto ocupará su espacio hasta matarlas
El término genérico
“cultivo de tejidos vegetales” involucra
a diferentes técnicas de cultivo de material
vegetal diverso, incluyendo a los protoplastos (células desprovistas de su pared celular), células, tejidos, órganos y plantas completas. Mediante éstas y otras técnicas de
cultivo, es posible obtener plantas libres de microbios en un medio nutritivo aséptico (estéril) en
condiciones ambientales controladas. También se lo conoce
como “cultivo in vitro de
plantas” por realizarse
en recipientes de vidrio (hoy también de otros materiales).
Las
primeras experiencias relacionadas con el cultivo de tejidos
vegetales se remontan a 1902, pero
recién en 1922 se logró el primer experimento exitoso:
la germinación in vitro de semillas
de orquídeas. Luego de la germinación, las plántulas obtenidas se
transfirieron a un medio de cultivo en condiciones asépticas, y así se mantuvieron protegidas
del ataque de patógenos
(hongos, virus y bacterias).
Hoy
esta técnica tiene numerosas aplicaciones,
algunas de ellas se ilustran
en la Figura 1:
• Propagación masiva de plantas,
especialmente para especies de difícil
propagación por otros métodos,
o en vías de extinción.
• Clonación de individuos
de características agronómicas muy deseables durante todo el año.
• Obtención
de
plantas libres de virus.
• Producción de semillas sintéticas.
• Conservación de germoplasma (conjunto de individuos que representan la variabilidad genética de una población vegetal).
• Obtención
de
metabolitos secundarios.
• Producción de
nuevos híbridos.
• Mejora genética de plantas (incluyendo obtención
de plantas transgénicas).
• Germinación de
semillas.
• Producción de
haploides.
• Estudios fisiológicos
diversos.
Figura 1. Algunas aplicaciones del cultivo de tejidos en plantas. En la de ariba, micropropagación de violeta
africana a partir de trozos de hojas desinfectados e introducidos en condiciones de esterilidad. En la de abajo, semillas sintéticas formadas
por embriones somáticos obtenidos por cultivo de células, encapsulados en una matriz inerte (como el alginato de
calcio).
Las
bases biológicas del cultivo de tejidos: la totipotencialidad
celular
La reproducción asexual
de plantas por cultivo de tejidos
es
posible gracias
a que, en general, varias células de
un
individuo vegetal
poseen la capacidad necesaria para permitir el
crecimiento y el desarrollo de un nuevo individuo completo, sin que
medie ningún tipo de fusión de células sexuales
o gametas. Esta capacidad se denomina totipotencialidad celular, y es característica de un grupo de células vegetales conocidas como
células meristemáticas, presentes en los distintos órganos de la planta. La potencialidadde una célula diferenciada (una célula de conducción, epidérmica, etc.)
para generar tejidos
nuevos y eventualmente un organismo
completo, disminuye con
el grado de diferenciación alcanzado por esa célula, pero puede revertirse
parcial o completamente según
las condiciones de cultivo a las que se la someta. Las células vegetales crecidas en
condiciones asépticas sobre
medios de cultivo adicionados
con hormonas vegetales, pueden dividirse
dando dos tipos de
respuesta:
• una desdiferenciación celular acompañada de crecimiento
tumoral, que da lugar a una masa de
células indiferenciadas denominada callo, la cual bajo las condiciones adecuadas es
capaz de generar órganos o embriones somáticos (llamados así porque son estructuras
similares a un embrión,
pero que no se originaron por
unión de gametas),
• una respuesta morfogenética por la cual se forman directamente órganos (organogénesis) o
embriones (embriones somáticos).
La primera respuesta se
conoce como organogénesis o embriogénesis indirecta (mediada por un
estado de callo) mientras que la
segunda respuesta se considera organogénesis o embriogénesis directa.
El cultivo
in vitro consiste en tomar una porción de una planta (a la que se denominará explanto, como por
ej. el ápice, una hoja o segmento de
ella, segmento de tallo, meristema, embrión, nudo, semilla, antera, etc.) y colocarla en un medio
nutritivo estéril (usualmente gelificado, semisólido) donde se
regenerarán una o muchas
plantas.
La formulación del medio
cambia según se quiera
obtener un tejido desdiferenciado (callo), crecer yemas y raíces, u obtener embriones
somáticos para producir semillas
artificiales.
El éxito en la propagación de una
planta dependerá de la posibilidad de
expresión de la potencialidad
celular total, es decir, que algunas células recuperen su condición meristemática. A
tal fin, debe inducirse primero la desdiferenciación y luego la rediferenciación
celular. Un proceso de este tipo
sucede durante la formación de las
raíces adventicias en el
enraizamiento de estacas, la formación de yemas
adventicias, o cuando se busca la propagación de begonias, violeta africana (ver figura 1) o peperonias mediante
porciones de hojas. Uno de los factores más importantes a tener en cuenta para lograr
la respuesta morfogenética deseada es la composición del
medio de cultivo.
No
existen dudas que en todo intento de propagación vegetal, ya sea in vitro o
in vivo, el carácter del
proceso de diferenciación depende del genoma de la especie,
y que
está regulado por el balance hormonal propio y por el
estado fisiológico del órgano, tejido o célula puesta en cultivo. Sin embargo,
también se sabe que ese
balance puede ser modificado
por el agregado de compuestos
que
imiten la acción de las hormonas vegetales. Estos compuestos se denominan reguladores del crecimiento, y se emplean
en los medios de cultivo para conseguir la
micropropagación de una planta.
La totipotencialidad
celular es clave en el desarrollo de plantas genéticamente
modificadas o transgénicas. Una vez realizada la transformación, ya
sea por Agrobacterium o por el método de biobalística, el paso siguiente es el cultivo in vitro, con el fin de
obtener, a partir del explanto inicial transformado, plántulas que lleven el transgén en todas
sus células (Figura 2).
Figura 2. Cultivo de tejidos y
transformación vegetal. En la figura se
observan explantos que, luego del proceso de selección, han
perdido coloración y aquellas células transformadas exitosamente
que se han desdiferenciado y
rediferenciado para dar origen a un brote
Pasos
necesarios para generar
plantas a partir de explantos aislados
En
los
protocolos utilizados durante
el cultivo in vitro
se
pueden
distinguir
las
siguientes etapas
(sintetizadas en la Figura 3):
1) Elección de la planta y/o tejido donante
de explantos.
2) Establecimiento, que consiste en la desinfección de los explantos (generalmente con hipoclorito
de sodio) y su posterior adaptación al medio
artificial de modo de inducir callo, brote, raíz o
embrión somático según se
desee.
3) Multiplicación, para generar una masa vegetal suficiente para la regeneración del número de plantas
necesarias.
4) Enraizamiento, en la que se busca la formación de raíces
con el fin de convertir los brotes o embriones somáticos en plántulas completas.
5) Rusticación, que es la aclimatación de las plántulas obtenidas in vitro a las condiciones ambientales ex vitro (suelo
o algún sustrato inerte)
El
éxito de la técnica
depende
de muchos factores,
entre ellos la edad de la planta (a mayor edad, menor potencial de regeneración), el genotipo y las condiciones
ambientales.
Entre
las ventajas del cultivo in vitro de material vegetal, se pueden
incluir los tiempos más cortos, y la posibilidad de ocupar
un espacio mucho más pequeño que si se desea propagar
material en tierra.
Figura 3. Etapas de la regeneración in vitro del maíz.
Elementos necesarios
para el cultivo de tejidos vegetales
Figura 4. Flujo
laminar
para el
cultivo de tejidos. Se observa uno de los modelos de flujo laminar que
puede usarse
para preservar la esterilidad de
las muestras
Además, se necesita un soporte para el explanto, que puede ser sólido o líquido, y que está conformado por algún agente gelificante inerte (agar, gelrite, etc.), macro y micronutrientes esenciales para la supervivencia de la planta, nutrientes (hidratos de carbono, vitaminas), agentes reguladores del crecimiento y hormonas vegetales (ver Tabla 1) que ayudarán a obtener una planta o un órgano en particular, a partir del explanto elegido. Algunos de los elementos mencionados pueden ser reemplazados por mezclas poco definidas en su composición (jugo de tomate, agua de coco, etc.)
Que pueden dar buenos resultados y generalmente resultan más económicas. La acidez de los medios de cultivo para plantas suele variar entre pH=5 y 6,5. Luego se regulan las condiciones de temperatura y de fotoperíodo (relación de horas luz y horas oscuridad).
Según sea el
balance hormonal y otras condiciones de cultivo,
se puede propiciar la
regeneración de
distintos órganos o formaciones vegetales. Por ej., si el balance de citoquininas/auxinas (ver Tabla 1) es mayor que 1, se favorece la generación de brotes; si es menor que 1, la generación de raíces; y si
es igual a 1, la formación de callos.
Tabla 1. Composición
de medios de cultivo para células
vegetales
Componentes
|
Características y ejemplos
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Agua destilada
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Representa
el 95% del medio nutriente
|
Fuente de carbono
|
Generalmente se
usa sacarosa. La fuente de carbono se necesita porque los explantos
no son completamente autótrofos, y no pueden cubrir sus necesidades con la fotosíntesis que pueden realizar in
vitro
|
Sustancias
inorgánicas
|
Macroelementos (N,
P, K, Ca,
Mg, S) y microelementos (Fe, Co, Zn, Ni, B, Al, Mn, Mo, Cu, I), en
una proporción
adecuada según la planta elegida.
|
Vitaminas
|
Vitaminas B1, B2, B6, vitamina H, vitamina E, ácido fólico,
ácido nicotínico, entre otras.
|
Hormonas y reguladores del crecimiento
|
Auxinas: promueven la elongación celular,
la formación de callos y raíces adventicias, inhiben
la formación de brotes
axilares adventicios
y, a veces, inhiben la embriogénesis.
Citoquininas: promueven la división celular, regulan el crecimiento
y el desarrollo de los tejidos vegetales.
Otras: giberelinas, ácido abscísico,
etileno.
|
Mezclas de sustancias poco definidas
|
Extracto de levadura, extractos vegetales.
|
Materiales inertes
|
Se
usan como soporte:
agar, agarosa, otros polisacáridos, lana de vidrio,
papel de filtro, arena.
|
El cultivo in vitro y la biotecnología:
Figura 5. La micropropagación vegetal. A partir de una planta madre se obtienen numerosos explantos que, sujetos a condiciones y medios de cultivo adecuados, darán lugar a nuevas plantas iguales a la planta original, permitiendo su multiplicación.
La micropropagación
La propagación de plantas in vitro es una técnica muy utilizada
en cultivos de importancia
económica. Permite cultivar células, tejidos, órganos,
semillas, embriones y
obtener individuos selectos en forma
rápida. Los cultivos son realizados por personal
especializado
en medios específicos
(hormonas, minerales, vitaminas, fuente de carbono, agente gelificante,
agua, etc.) y condiciones
ambientales controladas (temperatura,
humedad y luz) (Figura 5).
Una vez ajustados los
protocolos para la especie o
cultivo de interés, es posible automatizar el
proceso
de modo de llevarlo a mayor escala de producción.
La micropropagación
(propagación clonal por cultivo in
vitro) constituye uno de los métodos
biotecnológicos que
mayores logros ha aportado al desarrollo de la agricultura,
ya que se la usa en la producción masiva de especies hortícolas, aromáticas, medicinales, frutícolas, ornamentales y forestales
Entre
las ventajas de la micropropagación se pueden mencionar:
- Posibilita incrementar rápidamente nuevos materiales.
- Permite controlar
las condiciones ambientales,
debido a su independencia de los mismos (luz, temperatura y humedad controlada).
- Permite estudiar diversos procesos
fisiológicos.
- Evita el riesgo de contaminación
con patógenos, ya que se realiza en medios esterilizados.
- Se pueden
obtener gran cantidad de individuos en espacios reducidos.
- Permite la obtención de individuos
uniformes.
- Facilita el transporte del material.
El cultivo de meristemas
Figura 6. Cultivo de
meristemas. A partir de un meristema aislado se
puede obtener una planta completa. Adaptado de Biotecnología,
En la yema apical se encuentran un grupo de células que conforman el meristema apical (tiene un tamaño entre 0,01 y 0,3 mm), tejido embrionario que tiene la capacidad de formar todos los tejidos de la planta. A partir de ellos se pueden regenerar plantas completas (Figura 6).
En la yema apical se encuentran un grupo de células que conforman el meristema apical (tiene un tamaño entre 0,01 y 0,3 mm), tejido embrionario que tiene la capacidad de formar todos los tejidos de la planta. A partir de ellos se pueden regenerar plantas completas (Figura 6).
El cultivo de
meristemas tiene numerosas aplicaciones. Una de las más importantes es
la obtención de
plantas libres de virus, ya que esta pequeña zona de tejido generalmente no
es afectada por estos patógenos vegetales. Otra muy importante es la multiplicación vegetal. La potencialidad
de la técnica
se demuestra con un ejemplo: a partir de una yema apical, se pueden obtener 4.000.000 de claveles
en un año. La técnica permite también multiplicar especies de plantas con reproducción lenta o dificultosa (como
las orquídeas), o acelerar la
producción de plantas bianuales.
Cultivo de células y órganos
vegetales en biorreactores
Una vez obtenidos los
callos a partir de algún explanto, los mismos pueden
disgregarse para obtener
una suspensión de células. Esta suspensión puede utilizarse para generar embriones somáticos (la base de las
semillas
sintéticas), o puede directamente cultivarse
para producir
metabolitos secundarios, que son compuestos químicos
sintetizados por las células vegetales
en determinadas condiciones, con gran utilidad para las industrias farmacéutica y
alimenticia, entre otras. Por ejemplo, son metabolitos secundarios el
mentol y las drogas anticancerígenos vincristina y taxol, y algunos edulcorantes. Los cultivos celulares se llevan a
cabo en biorreactores, que son recipientes de
distinta capacidad
(de
unos
pocos
a
miles de litros),
diseñados
para propiciar
el crecimiento y/o la
multiplicación de distintos tipos de células
y/o órganos (Figura 7).
Las raíces vegetales también pueden
ser cultivadas en biorreactores,
especialmente aquellas transformadas por Agrobacterium rhizogenes, que produce un aumento abrupto en el
tamaño y ramificación de la raíz, aumentando así la biomasa, y por ende la cantidad del producto
deseado. Un ejemplo de
compuesto farmacológico
producido por
cultivo de raíces es el paclitaxel,
o taxol, que es utilizado como anticancerígeno.
Figura 7. Cultivo de células y
órganos vegetales. A partir de un explanto se pueden establecer cultivos de células para producir compuestos de interés, o para obtener embriones somáticos y semillas artificiales, entre otras aplicaciones. Adaptado de
“Biotecnología”,
UNQ 2006
BIBLIOGRAFIA
• Muñoz de Malajovich, M.
A. (2006) Biotecnología. Editorial Universidad Nacional de Quilmes
• Barceló et al. (1980) Fisiología vegetal. Editorial Pirámide
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Editorial
Continental
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Editorial Omega.
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In vitro culture of higher plants. Editorial
Martinus Nijhoff Publishers
• Strasburger, E. (1981) Tratado de Botánica. Editorial Marín
