TÉCNICAS DE SOUTHERN Y NORTHERN.
La reacción en cadena de la polimerasa,
conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), es
una técnica de biología molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un
gran número de copias de un fragmento de ADN
particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia
de ese fragmento original, o molde.
Esta técnica sirve para amplificar un
fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más
fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus obacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica
sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho
que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente
abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.
La PCR
Sensibilidad: se refiere a la cantidad mínima de ADN
necesaria para que se produzca la amplificación, es decir, para obtener una
banda. Se relaciona con los falsos negativos, ya que puede que una muestra sea
positivas pero sea dada como negativa porque no se ha amplificado por no tener
suficiente cantidad de ADN.
Especificidad: se refiere a la obtención de un solo
producto amplificado. Viene determinada por los oligos y la especificidad con
la que se unen al ADN molde. De esta forma, si los oligos tienen más de un
sitio al que se pueden unir aparecerá más de un producto amplificado.
Eficiencia: se refiere a la amplificación máxima
que se puede obtener en un número determinado de ciclos.
Fidelidad: se refiere a los errores que comete la
ADN polimerasa durante la amplificación. Este concepto es de especial
importancia en la secuenciación, pero en otros casos no es tan importante. Una
buena fidelidad permite evitar falsos positivos y/o negativos.
Southern:
es un método de biología molecular que permite detectar la
presencia de una secuencia de ADN en una mezcla compleja de este ácido nucleico. Para
ello, emplea la técnica de electroforesis en gel de agarosa con
el fin de separar los fragmentos de ADN de acuerdo a su longitud y, después,
una transferencia a una membrana en la cual se efectúa la hibridación de la sonda. Su nombre procede del apellido de su
inventor, un biólogo inglés llamado Edwin Southern.
Pasos de Southern
1. Extracción del ADN
Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido
humano. Las posibles fuentes de ADN en la escena de un delito incluyen sangre,
semen, tejido de una víctima muerta, células del folículo capilar y saliva. El
ADN extraído de las pruebas del delito ("indicios" o
"vestigios" biológicos) se compara con el extraído de muestras de
referencia, obtenidas de personas conocidas,habitualmente de la sangre.
2. Digestión del ADN con una endonucleasa de
restricción
El ADN extraído de la muestra se trata con una
endonucleasa de restricción,que es una enzima que corta el ADN bicatenario en
donde tenga una secuencia característica. La enzima que se usa más
frecuentemente para el análisis legal es HaeIII, que corta el ADN en la
secuencia 5'-GGCC-3'.
3. Electroforesis en gel de agarosa
Tras la digestión del ADN, los fragmentos de ADN
resultantes se separan según su tamaño mediante electroforesis en geles de
agarosa. Durante la electroforesis, las moléculas de ADN, que poseen carga
negativa, migran hacia el electrodo positivo. Al avanzar las moléculas de ADN,
su velocidad de migración se ve reducida por la matriz del gel de agarosa. Las
moléculas menores se mueven más deprisa a través de los poros del gel que las
de mayor tamaño. Como resultado, se produce una separación continua de los
fragmentos de ADN de acuerdo con su tamaño, de modo que los fragmentos más
pequeños avanzan la mayor distancia con referencia al origen o punto de
aplicación de la muestra.
4. Preparación de un ensayo de Southern
("Southern blot")
Tras la electroforesis, las moléculas de ADN
separadas se desnaturalizan mientras permanecen en el gel de agarosa,
impregnando éste con una disolución alcalina. Tras la neutralización de ésta,
el DNA monocatenario resultante se transfiere a la superficie de una membrana
de nailon,realizando así una copia o "calco" (la traducción más
literal del inglés blot,conservando este sentido, es "secante"). Este
proceso de desnaturalización y transferencia se conoce como método de Southern
en recuerdo de quien lo inventó, Edward Southern. Al igual que la aplicación de
un secante a un papel con la tinta húmeda transfiere una réplica de la imagen
del papel al secante,el "calco" del ADN en el gel a la membrana de
nailon conserva la distribución espacial de los fragmentos de ADN conseguida en
el gel como resultado de la electroforesis.
5. Hibridación con sonda radioactiva
Una sonda de locus único es una molécula pequeña de
ADN o ARN capaz de hibridar (es decir, de formar un dúplex ADN-ADN o ADN-ARN)
con el ADN de un fragmento de restricción concreto en el ensayo de Southern. La
formación de la molécula dicatenaria (dúplex) depende del emparejamiento de
bases complementarias entre las secuencias de la sonda y del ADN presente en
el"calco". Las sondas de locus único se marcan habitualmente con un
isótopo radiactivo para facilitar su detección, y se eligen para que detecten
un locus genético polimórfico en un solo cromosoma humano. El ensayo de
Southern resultante de la etapa 4 se incuba en una disolución que contiene una
sonda radiactiva de locus único, bajo condiciones de temperatura y concentración
desales que favorezcan la hibridación. Tras producirse ésta, se lava el exceso
de sonda no unido, de modo que la única radiactividad que quede en la membrana
de nailon sea la asociada al ADN del locus diana.
6. Detección de los RFLPs mediante autorradiografía
Las posiciones de hibridación de la sonda
radiactiva sobre la membrana del ensayo de Southern se detectan mediante
autorradiografía. En esta técnica,la membrana de nailon se coloca, una vez
lavada, junto a una película derayos X dentro de una caja que las aísle de la
luz. La película registra las posiciones donde hay desintegración radiactiva.
Tras su exposición y el revelado fotográfico, el registro resultante de la
hibridación de Southern se conoce como autor radiografía
7. Reensayar el resultado del Southern con sondas
adicionales
En un análisis legal de DNA se suelen caracterizar
polimorfismos de ADN en varios cromosomas diferentes. Tras el revelado de una autor
radiografía para la primera sonda, se puede lavar la radiactividad con una
disolución a elevada temperatura, que deja el ADN en su sitio, e hibridarlo con
una segunda sonda radiactiva que se una a un locus diferente. Se repiten así
las etapas 5-7, detectando cada vez un locus diferente. El grupo de autor
radiografías de una misma transferencia de Southern se conoce como un
"perfil de ADN"
Northern:
Es una
técnica de detección de moléculas de ácido ribonucleico (ARN) de una secuencia dada dentro de
una mezcla compleja (por ejemplo, un ARN mensajero para un péptido dado en una extracción de ARN total).
Para ello, se toma la mezcla de ARN y se somete a una electroforesis en
gel a fin
de separar los fragmentos en base a su tamaño. Tras esto, se transfiere el
contenido del gel, ya resuelto, a una membrana cargada positivamente en la cual
se efectúa la hibridación de una sonda molecular marcada radiactiva o químicamente.
El nombre de la técnica deriva de la
propia de la detección de ácido
desoxirribonucleico (ADN),
denominada Southern blot en honor a su descubridor; de este
modo, al desarrollarse la técnica equivalente para ARN se empleó el punto
cardinal opuesto («northern», septentrional en inglés, frente al meridional
«southern»). El northern blot fue desarrollado en 1977 por James Alwine, David
Kemp y George Stark en la Universidad de
Stanford.
Procedimiento
El procedimiento general comienza con
la extracción del RNA total de una muestra de tejido
homogenizado. El mRNA se puede aislar a través del uso de cromatografía para mantener solamente los ARN con colas de
poli-A. Las muestras de ARN son entonces separadas por electroforesis en
gel. Dada la fragilidad de los geles y la incapacidad de las sondas
para penetrar en la matriz, las muestras de RNA, separadas por tamaño tras la
electroforesis, serán tranferidas a una membrana de Nailon por medio de
capilaridad o un sistema de transferencia al vacío.
Una membrana de Nylon cargada positivamente es el soporte más
efectivo para usar en el northern blot ya que los ácidos nucleicos,
que están cargados negativamente, tienen una alta afinidad por estas membranas.
El buffer de transferencia usado para el
ensayo suele contener formamida, dado que ésta consigue disminuir
la temperatura de hibridación de la sonda, lo cual previene la degradación del
ARN por las altas temperaturas. Una vez que el ARN ha sido transferido a la
membrana, este es inmovilizado a través de enlaces covalentes
formados con la membrana, lo cual se consigue por medio de luz ultravioleta o calor.
Después del marcaje de la sonda, ésta se hibrida con el RNA en la
membrana. Las condiciones experimentales que pueden afectar la eficiencia y
especificidad de la hibridación están determinadas por las condiciones iónicas,
de viscosidad, la presencia de dobles hebras de RNA, bases desemparejadas y composición de las
mismas. Finalmente, la membrana debe de lavarse para asegurar que la sonda se
ha unido de forma específica y para evitar ruido de fondo en las señales
emitidas por la misma.
Estas señales serán
detectadas porRayos X y
pueden ser cuantificadas mediante técnicas de densitometría. Para crear controles y poder
asegurarnos de que no se están mostrando genes que no nos interesen se puede
realizar posteriormente la determinación por microarrays o RT-PCR.
Las muestras de RNA son normalmente
separadas en geles de agarosa que contienen formaldehído como agente desnaturalizante del RNA
para obtener su estructura secundaria.
Los geles pueden ser teñidos con bromuro de etidio y visualizados bajo luz ultravioleta para observar el RNA. Los geles de poliacrilamida con urea también pueden utilizarse, aunque esto
suele limitarse a fragmentos de RNA o miRNA,
ya que crean un tamaño de poro mas estrecho en su matriz, por lo que el RNA que
suele utilizarse no podría desplazarse por el gel.
Suele utilizarse además un patrón de
RNA con muestras de tamaño conocido para poder extrapolar el tamaño de las
muestras en estudio.
Sondas
Las sondas del northern blot están
compuestas por ácidos nucleicos con una secuencia complementaria a todo o parte
del RNA que nos interesa. Pueden ser de DNA, RNA o oligonucleótidos, con un
mínimo de 25 bases complementarias para nuestra secuencia diana.
Las sondas de RNA o ribosondas que se transcriben in vitro ayudan a prevenir el ruido de fondo.
Normalmente, el DNA complementario se sintetiza con cebadores para la secuencia
RNA de interés para actuar como sonda en el Northern blot.
Las sondas requieren ser marcadas bien
con isótopos
radiactivos (32P)
o con quimioluminiscencia,
ya sea con fosfatasa alcalina o con peroxidasa
de rábano, las cuáles, tras la adición de su sustrato específico
producen una emisión de luz detectable.
El marcaje por quimioluminiscencia
puede hacerse de dos formas: Por un lado, la sonda puede estar unida a la
enzima o bien unida a un ligando (p.ej, biotina) para la cual hay un anticuerpo (avidina o estreptavidina en este caso) está unido a la enzima
que revelará el marcaje.
Los Rayos X pueden detectar tanto las
señales radioactivas como las quimioluminiscentes, siendo preferida por muchos
investigadores la segunda, dada su mayor rapidez, sensibilidad y reducción de
los riesgos para la salud que conlleva trabajar con compuestos radioactivos.
Aplicaciones
El northern Blot permite observar un
patrón particular de expresión genética entre tejidos, órganos, estadios del
desarrollo, niveles de estrés ambiental, infecciones causadas por patógenos y
durante el curso del tratamiento de las mismas. Esta técnica se ha utilizado
para mostrar la sobreexpresión de oncogenes y la desregulación de genes supresores
tumorales en células cancerosas cuando son comparadas con tejidos
normales.
Los patrones de expresión obtenidos nos
ayudan a conocer las funciones de los genes. Desde que el RNA se separó por su
tamaño, las sondas contra el mismo pueden darnos una idea de su tamaño, sugerir ayuste alternativo,
o motivos repetidos en la secuencia. La variación en el tamaño del producto de
un gen puede además indicarnos deleciones o errores en el proceso de
transcripción. Alterando la sonda podemos conocer la secuencia e incluso
determinar que región del RNA ha sido delecionada.
Ventajas y Desventajas
El análisis de la expresión génica
puede realizarse por diversos métodos, como RT-PCR, Ensaños de protección de
RNasa, microarrays, Análisis seriado de expresión génica así como el Northern
Blot. Los microarrays son los mas utilizados y son generalmente consistentes
con los datos obtenidos por el Northern Blot. No obstante, en ocasiones el
Northern Blot es capaz de detectar pequeños cambios en la expresión de genes
que los microarrays no pueden identificar.
Ventajas adicionales de usar el método
de Northern Blot incluyen la habilidad de definir el tamaño de la cadena de
ARN, la habilidad de observar los productos del empalme
alternativo, la posibilidad de usar sondas con homología parcial, la
habilidad de medir el tamaño y la calidad del ARN antes de realizar la
inmovilización en la membrana y finalmente la opción de guardar la membrana
para ser analizada en repetidas ocasiones en el futuro.
Un problema común del northern blot es
que la degradación de la muestra por RNAsas (endógenas de la muestra o a través
de contaminación ambiental) que puede ser evitada por una apropiada
esterilización de los materiales así como el uso de inhibidores de RNAsas como
el dietilpirocarbonato
Northern Blot reverso
Una versión alternativa del método es
conocidad como Northern Blot reverso. En ésta, el ácido nucleico que actua como
sustrato (fijo en la membrana) está conformado por fragmentos aislados de ADN,
mientras que la sonda está conformada por ARN obtenido de los tejidos y
etiquetada con material radioactivo.
Esta variante es más compatible con el
uso de un chip de ADN, que se ha convertido en
practica común en la parte final de la década de 1990 y la primera del siglo
XXI. Ambas prácticas requieren la fijación de fragmentos de ADN como su
hibridación con sondas de ARN celular. De esta manera el proceso en reverso,
aunque inicialmente era poco común, permitió que el Northern Blot evolucionara
hasta tener un lugar en el desarrollo de los perfiles de
expresión génica.
CONCLUSIÓN GENERAL
Southern
El método tipo Southern o Southern blot fue desarrollado para la detección de
genes específicos en el ADN celular.
El ADN es digerido con una enzima de
restricción y los
fragmentos son separados por tamaños mediante electroforesis en un gel.
A continuación los fragmentos de ADN de doble cadena son desnaturalizados
mediante un proceso químico separando las dos hebras componentes del ADN en sus
cadenas sencillas. Posteriormente, el ADN inserto en el gel es transferido a un
filtro de nitrocelulosa, con lo que en el filtro
queda representada una réplica de la disposición de los fragmentos de ADN
presentes en el gel. A continuación el filtro se incuba durante un tiempo con
la sonda marcada (radiactivamente o con un fluorocromo); durante la incubación
la sonda se va hibridando con las moléculas de ADN de cadena sencilla de
secuencia complementaria (o muy parecida). La sonda unida al fragmento de ADN
complementario se puede visualizar en el filtro de una forma sencilla mediante
una exposición a una película de rayos X para el caso de sondas radiactivas o
con una película sensible a la luz, para el caso de sondas con fluorocromo
Northern
El segundo método, tipo Northern blot o Northern, se
utiliza para identificar las cadenas de ARN de secuencia semejante al ADN que se
usa como sonda; a diferencia del tipo Southern que se utiliza para identificar
ADN, el método Northern sirve para identificar ARN.
El ARN se extrae y se fracciona en
tamaños variables mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida en unas
condiciones que mantengan las cadenas de ARN en estado desnaturalizado. El
proceso continúa de forma semejante a la hibridación de tipo Southern. El
método del Northern se utiliza muy frecuentemente para realizar estudios de expresión génica;
para conocer qué genes están activos formando ARN mensajero en qué condiciones,
en qué tejidos o tipos celulares.
