martes, 6 de marzo de 2012


TRABAJO DE INVESTIGACION DEL EXPERIMENTO DE MESELSON Y STAHL.

ALUMNO: CANDIDDO TORRES SANTIBAÑEZ
CON # DE CONTROL:09930058.

CARRERA: LICENCIATURA DE BIOLOGIA
IV SEMESTRE.

07/03/2012.




INTRODUCCION


El experimento de Meselson-Stahl fue un experimento realizado en 1957 por Matthew Meselson y Franklin Stahl en el que se demostró que la replicación de ADN era semiconservadora.  

Para investigar la forma de replicación del ADN, Meselsohn y Stahl idearon una forma muy ingeniosa que se basa en dos premisas fundamentales, por una parte está el hecho de que el nitrógeno es uno de los principales elementos del ADN, y por la otra el nitrógeno posee dos isótopos que pueden ser distinguidos mediante técnicas de laboratorio.
Aunque el 14N es el isótopo más abundante del nitrógeno, el ADN es también viable con el isótopo 15N el cual es más pesado. El isótopo 15N no es radioactivo, solo es más pesado que el nitrógeno común.
De esta forma Meselsohn y Stahl mediante un inteligente planteo del experimento, en el que utilizaron bacterias y observaron cómo replicaban su ADN, pudieron obtener información que les permitió identificar el mecanismo de replicación del ADN y descartar ciertas teorías alternativas.

METODOLOGIA:

En dicho trabajo se pretende dar una ilacion de como fue el experimnto de meselson y stahl. con la sencilla razon de aprender mas del area de la biologia y cumplir con el objetivo.
   
OBJETIVO
Entender las bases moleculares del control de la expresión génica y de la manipulación del ADN mediante el empleo de las diferentes técnicas moleculares que le permitan desarrollar proyectos de investigación básica y aplicada.

EVIDENCIAS
DESARROLLO DE LA EXPERIMENTACION


Se realizó un cultivo de E. coli durante varias generaciones en un medio con 15N. Al extraer ADN de estas células y centrifugarlo en un gradiente de cloruro de cesio, las moléculas de ADN se situaban en el punto donde su densidad igualaba la del medio.

 El ADN de estas células tenía una mayor densidad que el de otras cultivadas con 14N. Posteriormente, las células de E. coli que sólo contenían 15N en su ADN se colocaron en un medio con 14N y se les permitió que se replicaran una sola vez. Se extrajo el ADN de estas células y se comparó con el preparado con 14N y con el preparado con 15N, encontrando que su densidad era prácticamente el promedio.

 Dado que una replicación conservadora hubiera producido iguales cantidades de ADN de mayor y menor densidad (pero sin producir ADN de una densidad intermedia), se descartó que la replicación siguiera el mecanismo conservador. Sin embargo, este resultado era consistente tanto con una replicación semiconservadora como con una de tipo dispersante.

Una replicación semiconservadora hubiera dado por resultado una doble hélice de ADN donde un filamento tiene 15N mientras que el otro filamento tiene 14N, mientras que una replicación dispersante hubiera dado por resultado una doble hélice de ADN con ambos filamentos conteniendo mezclas de 15N y 14N; en ambos casos la densidad del ADN tendría un valor promedio entre las densidades de los ADN de 15N y 14N.
Se extrajo ADN de células que habían crecido por varias generaciones en un medio con 15N, y a las que se les había permitido que realizaran dos replicaciones en un medio con 14N.

Al analizar estas células se encontró que contenían cantidades iguales de ADN con dos densidades distintas, una igual a la obtenida tras una sola replicación en un medio con 14N, mientras que la otra correspondía al ADN producido exclusivamente con 14N.

Este resultado era claramente inconsistente con una replicación dispersante, que hubiera dado como producto ADN con una densidad única e inferior a la de una sola generación, pero mayor que la de 14N, ya que el ADN original con 15N se habría repartido de forma uniforme entre todos los filamentos de ADN.

 Este resultado era consistente con una replicación semiconservadora, en cuanto a que la mitad del ADN de segunda generación tiene un filamento original con 15N y otro con 14N, lo que da como resultado un ADN con una densidad intermedia, mientras que la otra mitad del ADN contiene en su totalidad 14N --un filamento sintetizado en la primera división y otro en la segunda división.

Este descubrimiento fue sumamente importante en el desarrollo de la biología y es de gran ayuda en la investigación y tratamiento de enfermedades (por ejemplo cáncer).
Meselson y Stahl prueban que el modelo semiconservativo de la replicación del ADN es correcto.


Las figuras siguientes ilustran el experimento Meselson y Stahl que demostró lo correcto del modelo semiconservativo de la replicación del ADN. Usted será capaz de "correr" la centrifugación del CsCl ( cloruro de cesio) y ver la banda o bandas del ADN para cada condición de cultivo (el tubo derecho en cada caso), comparado con la banda control, marcada como 14N (ligera) del ADN ( tubo izquierdo). Haga Click sobre cada tubo de muestreo de ADN para correr la centrifugación. Haga Click sobre "de cerca" para más información sobre el Cloruro de Cesio.
  1. Las bacterias crecen en el medio 14N o 15N.
  2. Muestras removidas y el ADN extraído.
    3. Centrifugue las muestras de ADN haciendo click en los tubos de muestra de ADN de abajo.
       
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Descripción del experimento Meselson y Stahl
Meselson y Stahl probaron la hipótesis de la replicación del ADN. Ellos cultivaron bacterias en un medio 15N.
 El 15N es un isótopo pesado de nitrógeno, por lo tanto el ADN sintetizado es de densidad pesada. Ellos entonces cambiaron las bacterias al medio 14N. El ADN se aisló diferentes veces que corresponden a los ciclos de replicación 0, 1, y 2. Después de un ciclo de replicación, el ADN fue todo de densidad intermedia.

Esto descarta el modelo conservador de la replicación, que predice que ambos ADN (pesado y liviano) estarán presentes, pero ninguno de densidad intermedia estará presente.

Este resultado es consistente con el modelo semiconservativo de replicación, que predice que todas las moléculas de ADN consistirán de una cadena 15N de ADN y una cadena 14N de ADN.

El resultado no descarta el modelo dispersivo de replicación, que también predice que todo el ADN será de densidad intermedia, consistiendo de segmentos intercalados de doble cadena 15N y 14N.

Después de dos ciclos de replicación, se ven dos bandas de ADN, una de densidad intermedia y una de densidad liviana. Este resultado es exactamente lo que el modelo semiconservativo predice: la mitad debería ser densidad intermedia 15N-14N la intermedia y la mitad de densidad liviana 14N-14N.

Este resultado descarta el modelo dispersivo de la replicación, que predice que después del ciclo 1 de replicación, la densidad del todas las moléculas de ADN, gradualmente llegarían a ser más bajas. Por lo tanto, ningún ADN de densidad intermedia intermedio debería permanecer después del ciclo 2. El modelo semiconservativo es correcto

Modelo semiconservativo de la replicación del ADN.





REPLICANDO EL ADN.




MODELOS DE REPLICACIÓN PROPUESTOS: SEMICONSERVATIVO, CONSERVATIVO Y DISPERSIVO

Modelo Semiconservativo: Cuando Watson y Crick (1953) propusieron el modelo de la Doble Hélice indicaron que dicho modelo sugería una forma sencilla de replicación. El modelo de replicación propuesto por Watson y Crick suponía que el ADN doble hélice separa sus dos hebras y cada una sirve de molde para sintetizar una nueva hebra siguiendo las reglas de complementariadad de las bases nitrogenadas. Dicho modelo recibión el nombre de Semiconservativo, ya que las dos dobles hélices recién sintetizadas poseen una hebra vieja (una mitad vieja) y otra hebra nueva (mitad nueva).
Frente al modelo Semiconservativo propuesto por Watson y Crick (1953) se postularon otros posibles modelos de replicación del ADN, uno de ellos se denominó Modelo Conservativo y otro Modelo Dispersivo.

Modelo Conservativo: cuando el ADN doble hélice se replica se producen dos dobles hélices, una de ellas tienen las dos hebras viejas (esta intacta, se conserva) y la otra doble hélice posee ambas hebras de nueva síntesis.

Modelo Dispersivo: Cuando el ADN doble hélice se replica se originan dos dobles hélices, cada una de ellas con hebras que poseen tramos viejos y tramos de nueva síntesis en diferentes proporciones.
Los siguientes esquemas representan los tres Modelos de Replicación:





 

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LA REPLICACIÓN DEL ADN BACTERIANO SE AJUSTA AL MODELO SEMICONSERVATIVO: EXPERIMENTOS DE MESELSON Y STAHL (1958

Meselson y Stahl (1957) diseñaron un experimento para tratar de averiguar la forma en la que se realiza la replicación del ADN en E. coli, es decir, la pregunta que se plantearon fue: ¿Qué modelo de replicación del ADN sigue E. coli, semiconservativo, conservativo o dispersivo?.

 Para contestar a esta pregunta, diseñaron un experimento en el que marcaban el ADN de la bacteria E. coli con Nitrógeno pesado N15, para ello hicieron crecer las bacterias durante 14 generaciones sucesivas en un medio que contenía como única fuente de Nitrógeno N15.

Durante estas 14 generaciones el ADN de las bacterias las bacterias se había sintetizado con bases nitrogenadas con Nitrógeno pesado (N15). Posteriormente, comprobaron que podían distinguir el ADN del las bacterias que crecían en un medio normal (con N14) del ADN de las bacterias que habían crecido durante 14 generaciones en N15.

Para ello extrajeron el ADN de ambos tipos de bacterias y lo centrifugaron en un gradiente de densidad de CsCl.

 El resultado fue que la densidad del ADN de las bacterias que habían crecido en presencia de N15 era mayor que el ADN de las bacterias que habían crecido con N14

 Una vez comprobado que eran capaces de distinguir el ADN de ambos tipos de bacterias, continuaron el experimento de la siguiente forma:

                             Las bacterias que habían estado creciendo en Nitrógeno pesado (N15) las pasaron a un medio de cultivo que contenía N14 (Nitrógeno normal) y a distintos tiempos, media generación,   una generación, dos generaciones, tres generaciones de replicación, tomaban una muestra del cultivo bacteriano, extraían el ADN y centrifugaban en gradiente de densidad de CsCl.



Cuando extraían el ADN de la bacterias que llevaban una generación creciendo en N14 y centrifugaban en CsCl, obtenían una sola banda de densidad intermedia (N14-15)entre la del ADN N14 y el ADN N15. Si extraían el ADN de las bacterias que llevaban dos generaciones creciendo en N14 y centrifugaban en gradiente de CsCl obtenían dos bandas, una correspondiente al ADN N14 y otra de densidad intermedia (N14-15) entre la del ADN N14 y el ADN N15. La absorbancia  a 260 nm es directamente proporcional a la cantidad de ADN que contiene una banda, de manera que al medir la absorbancia de las dos bandas obtenidas en la segunda generación, obtenían que ambas contenían igual cantidad de ADN (1:1). Al extraer y centrifugar en CsCl el ADN de las bacterias que llevaban tres generaciones creciendo en N14, obtenían dos bandas, una correspondiente al ADN N14 y otra de densidad intermedia (N14-15) entre la del ADN N14 y el ADN N15. La cantidad de ADN que contenía la banda correspondiente al ADN N14 era tres veces mayor que la encontrada en la  banda de densidad intermedia (N14-15), proporción (3:1).
Los resultados obtenidos por Meselson y Stahl (1958) se ajustaban a un modelo de replicación semiconservativo. Para asegurarse, aislaron la banda de ADN de densidad intermedia (N14-15) obtenida a partir de las bacterias que llevaban una generación en N14, desnaturalizaron el ADN de la banda mediante calor para separar sus dos hélices y, manteniéndolas desnaturalizadas, centrifugaron en CsCl. Si la replicación de E. coli se ajustaba al modelo semiconservativo, una de las hélices debería estar construida con N15 (la vieja) y la otra hélice con N14 (la nueva) y, al centrifugar en gradiente de densidad esperaríamos obtener dos bandas una más densa correspondiente a la hélice construida con N15 y otra menos densa sintetizada con  N14. El resultado obtenido por Meselson y Stahl (1958) fue precisamente el esperado para una replicación semiconservativa.


Resultados centrifugación CsCl   .




Matthew Meselson y Franklin W. Stahl
·         Si la replicación del ADN de E. coli se ajustará al modelo Conservativo al centrifugar el ADN de las bacterias después de un generación en medio con N14, hubieran obtenido dos bandas una de densidad correspondiente al N14  y otra de densidad correspondiente al N15. Nunca habrían observado, en este caso,  una banda de ADN de densidad intermedia (N14-15).

CONCLUCION


CON DICHA INVESTIGACION SE PRETENDE APPRENDER MAS DE LA MATERIA I Y QUE SE CUMPLA CON EL OBJETIVO .
ADEMAS QUE ESTA INVESTIGACION YA QUE ES PUBLICADA SIRVE COMO AVAL DE MEJORAR EL CONOCIMIENTO.

 BIBLIOGRAFÍA

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