domingo, 10 de junio de 2012


INSTITUTO TECNOLOGICO DE CD ALTAMIRANO.

  UNIDAD # 10. TÉCNICAS DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR
LICENCIATURA EN BIOLOGIA QUINTO SEMESTRE.

QUE PRESENTA:
CANDIDO TORRES SANTIBAÑEZ.
CON # DE CONTROL: 09930058.

PROFESOR: FRANCISCO JAVIER PUCHE ACOSTA.
ASIGNATURA: BIOLOGIA MOLECULAR.
JUNIO/2012.




 UNIDAD # 10.TÉCNICAS DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR

 10.1 Métodos de purificación y análisis de los ácidos nucleicos.
10.2 Técnicas de hibridación.
10.3 Técnicas de clonación de genes.
10.4 Prueba de PCR en el diagnostico de enfermedades
10.5 Genéticas
10.6 Por microorganismos (bacterianas, protozoarios, entre otros)
10.7 Tecnología del ADN recombinante. 



INTRODUCCIÓN.

TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

Las técnicas de biología molecular están basadas en la asociación de alteraciones de los ácidos nucleicos con el cáncer.

Las células tumorales se caracterizan por presentar alteraciones genéticas y epigenéticas. Las mutaciones somáticas puntuales en oncogenes o genes supresores del tumor son frecuentes, observándose anormalidades cromosómicas como reordenamientos, delecciones, amplificaciones y aneuploidías. Son señales de inestabilidad genómica y son características del fenotipo maligno. Estas alteraciones son utilizadas como marcadores moleculares para poder detectar las células tumorales en las muestras clínicas.
La mayor ventaja de estos ensayos es la gran estabilidad de la molécula de DNA, si lo comparamos con la de las proteínas o RNA, ya que la pérdida de sensibilidad debida a la degradación enzimática durante el almacenamiento o transporte de las muestras clínicas es menos crítica en este tipo de estudio (Jeannine et al., 2001).


¿A qué se denominan técnicas de biología molecular?


En principio se denomina así a todas las técnicas de laboratorio que se usan para aislar ADN o extraerlo en alta pureza, visualizarlo para ver su estado, cortarlo y pegarlo (nacimiento de la Ingeniería genética), amplificar una región en una enorme cantidad de moléculas (clonación de fragmentos en bacterias u otros vectores como virus y PCR), corte de una determinada región con enzimas de restricción para ver si por una mutación se gana o se pierde un sitio de restricción (análisis de mutaciones por RFLP o Restriction fragment lengt polymorphism), que siginifica: diferencias en los tamaños de los fragmentos de restricción debido a polimorfismos en el ADN entre otras.
Todas estas técnicas tiene diversas aplicaciones generalmente en el diagnóstico de enfermedades hereditarias, búsqueda de alelos mas o menos frecuentes asociados a una característica que nos interesa seleccionar, diagnóstico de contaminación bacteriana en alimentos (detección de Escherichi coli 0257, cepas difrenctes de Salmonellas, Mycobacterium sp) diagnóstico viral o de infección viral (HIV, Hpatitis C, PIF, otros), selección de marcadores moleculares para asistir en el mejoramiento genético de una especie, test de paternidad, diganóstico de identidad forense, etc.
La primera técnica que todas las demás necesitan es la extracción del ADN, y para ello es necesario purificarlo desde cualquier tejido aunque usualmente se hace a partir de sangre. Se basa en una serie de lavados de la muestra y agregado de proteinasas que eliminan las proteínas del medio, detergentes para elminar las membranas plasmáticas y luego ir purificando el ADN de esa mezcla de ARN proteínas y restos celulares.
¿Como visualizamos el ADN?
Para poder visualizar el ADN debemos recurrir a los geles de Agarosa. Una vez extraído el ADN o hecha una reacción de PCR debemos verificar que el ADN está allí.

Para eso debemos prepar un gel de agarosa, con una serie de pocillos donde colocar las muestras que sumergidas en el gel y este en un buffer conductor, como el ADN tiene carga negativa migrará hacia el polo positivo si le hacemos pasar una corriente eléctrica.
La Genética molecular aparece desde el descubrimiento de la doble hélice de ADN de Watson y Crick en 1954. Luego Francis Crick continúa con el descubrimiento del código genético en los 60’s. Es decir se descubrió que las bases del ADN se leen de a 3, y tres combinaciones de letras significan un aminoácido que formará parte de una proteína. Allí comienza a comprenderse como es la molécula de ADN y como lleva la información que contiene a la célula que la contiene. A esto se lo denominó “Dogma central de la biología molecular”.
Luego aparece el descubrimiento de las enzimas de restricción que permiten cortar el ADN y así analizarlo. Nace allí la ingeniería genética. Eso permitió cortar y pegar a la molécula de ADN para estudiarla, analizar patologías en ciertos genes, etc. Hasta que, hacia fines de los 80’s, Karl Mullis descubre la técnica de PCR que revolucionó a la genética por su paracticidad y rapidez para amplificar una region de ADN en cantidad suficiente para luego hacer todo tipo de análisis.

La secuenciación fue descubierta por Sanger

Gracias a este descubrimiento fueron posibles el uso de muchas técnicas para realizar tanto la secuenciación completa del genoma humano como el de muchos animales domésticos y ademas usar la secuenciación que hoy en día es automática y realizada por un secuenciador en múltiples aplicaciones.
Una de las aplicaciones de los secuenciadores es el fingerprinting o huellas de DNA que permite tanto la realización de test de paternidad como identificación de criminales. En las primeras epocas esta técnica de huellas de ADN descubierta por Sir Alec Jeffries y se realizaba por Southern blot, en honor a su descubridor llamado de apellido Southern, pero hoy en día se realiza por PCR.
La primera técnica utilizada para la identificación de fragmentos de ADN fue el Southern blot. Se transfiere al ADN de un gel de agarosa a una membrana donde se hibridiza con una sonda marcada radioactivamente. Luego llegaron el north ten y el western para detectar fragmentos de ARN proteínas respectivamente.


Aplicaciones de las técnicas

Son inmumerables las aplicaciones de estas técnicas y quizás las más usadas hoy en dia, son la PCR seguida de una restricción con enzimas y detección de los fragmentos en un gel o seguidas de un gel de poliacrilamida que tiene más definición para la separación de fragmentos de pocas bases de diferencias. Cuando se usa PCR y enzimas de restricción se denominan PCR/RFLP (derivado de variación en la longitud de los fragmentos de restricción en ingles).

Esta técnica puede usarse entre otras cosas para detección de alelos de un gen normales y mutados (enfermedades hereditarias) o para distinguir cepas bacterianas o virales o alelos más favorables para una característica de interés productivo para luego aplicarlo a la selección.


METODOLOGIA.


La metodología que se utiliza son los pasos a seguir para la manifestación y desenlace  de la unidad # 10 y con sus correspondientes subtemas:  realizando enlaces de acuerdo a lo manifestado en clases de la unidad por el maestro y hacer conclusiones a lo entendido al final de la unidad de todos los subtemas, publicando lo más interesante yde cada tema visto en clase. y trabajos o ensayos obtenidos correspondiente a cada clase.



EVIDENCIAS.

UNIDAD 10 TÉCNICAS DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR

10.1 MÉTODOS  DE PURIFICACIÓN  Y ANÁLISIS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS.

OBTENCIÓN DE ADN Y SEPARACIÓN DE FRAGMENTOS DE ADN.

A un laboratorio de Biología Molecular llegan  distintos tipos de muestras, cada una con sus peculiaridades a la hora de analizar y obtener su ADN. “A priori” se plantean dos situaciones diferentes. Si lo que se pretende es conocer la ubicación física del ADN/ARN de interés en un  corte histológico se deberá  proceder a estudios “in situ”, mientras que si no es necesario conocer dicha ubicación será suficiente con obtener el ADN celular en solución. El ADN en solución  es una mezcla de ADN mitocondrial, nuclear eucariota y viral/bacteriano si estuvieran presentes en la muestra virus/bacterias.

 Centrándose en la obtención de ADN en solución existen diferentes métodos de lisis: lisis diferencial, lisis neutra... Una vez realizada la lisis, la solución de ADN obtenida no siempre es apta para utilizar en las reacciones posteriores de amplificación, restricción, marcaje o secuenciación, por lo que es conveniente por un lado separar el ADN del resto de macromoléculas que lo acompañan, preferentemente proteínas, proceso que suele realizarse con ayuda de solventes  orgánicos (fenol y cloroformo) y, por otro separar el ADN de aquellas moléculas de pequeño tamaño con actividad inhibidora presentes en la solución de ADN. El ADN una vez limpio de proteínas y/o pequeñas moléculas puede ser utilizado directamente, si bien en la mayoría de las situaciones es necesario concentrarlo mediante ultrafiltración o precipitación con alcohol.
 El sistema de valoración de la concentración de ADN será función de cuales han sido los tratamientos y, por tanto, del grado de pureza del ADN obtenido. 

Pueden emplearse desde métodos altamente sensibles y exactos como la espectrofotometría y fluorometría, hasta métodos aproximativos, tales como  la comparación  del grado de fluorescencia respecto a un control de concentración conocida.
Una vez conocida la concentración del ADN, éste será utilizado básicamente con el propósito de amplificar determinadas secuencias del mismo mediante PCR.
En ciertos casos la simple detección del fragmento amplificado tiene valor diagnóstico por sí mismo. La metodología empleada para la detección puede ser:

1.      separación y visualización de dicho fragmento en geles adecuados de agarosa o poliacrilamida (Ej. detección de infección por virus de la hepatitis, SIDA, HPV oncogénicos...). En otros casos el valor diagnóstico se obtiene por comparación de la movilidad del fragmento en un gel, respecto a un fragmento de características conocidas (Ej. movilidad de un exon mutado del gen supresor p53 en relación al mismo exon normal...), o bien,

2.      detección del fragmento amplificado mediante ELISA con revelado colorimétrico o quimioluminiscente.
Por el contrario, en otros casos el valor diagnóstico se alcanza una vez que el fragmento amplificado se analiza mediante cualquiera de las siguientes técnicas:
 
1.      Corte con enzimas de restricción. Los fragmentos generados en la restricción se separan en geles de agarosa o poliacrilamida adecuados (Ej. Tipificación HPV, genotipado ApoE...).

2.      Hibridación.  Los fragmentos generados en el PCR se separan en  gel de agarosa, se transfieren a un soporte adecuado (nitrocelulosa, nylon), y finalmente se hibridan con un ADN sonda marcado (Ej. Tipificación de los genes HLA Clase II...).

3.      Secuenciación.  Los fragmentos generados durante la reacción de secuenciación se separan en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (Ej. Secuenciación de genes mitocondriales mutados implicados en ciertas enfermedades).



10.2 TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN 

                                                      LA HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Es un proceso de unión de dos hebras complementarias de ácidos nucleicos pero cuyo origen es distinto. Una de ellas será el ácido nucleico diana y la otra será la sonda empleada para localizar ese ácido nucleico diana.


formato de hibridacion

Técnicas de hibridación

Hibridación in situ con filtro (HISF). Este método tampoco precisa de extracción de ADN y analiza muestras obtenidas por raspado o con torunda o cepillo. Las células se aplican directamente sobre un filtro el cual se trata con sustancias alcalinas para la lisis celular y la desnaturalización del ADN. El método HISF es de muy fácil ejecución, rápido y barato es ,sin embargo, poco específico y, a menudo, resulta difícil separar las señales positivas del fondo. Su uso se limita a trabajos con gran cantidad de especímenes. 
  
Hibridación Southern blot (SB). Necesita de la extracción del ADN de la muestra con fenol/cloroformo y de la eliminación de ARN y proteinas de la misma por digestión enzimática. Con la aplicación de endonucleasas de restricción-la enzima Pst I es la mas utilizada, pues corta los genomas de HPVs en fragmentos de diferentes tamaños ofreciendo un patrón característico en el gel de agarosa-el ADN se rompe, realizándose una separación electroforética de los fragmentos en gel de agarosa los cuales pueden ser visualizados con bromuro de etidio. El ADN se desnaturaliza y se transfiere a una membrana realizándose una hibridación. 

El SB es el método de referencia actual para el tipaje de HPVs. La especificidad de esta técnica es superior a cualquier otra debido a la purificación extra del ADN por electroforesis. Además es el único método que permite conocer si el genoma viral está en situación episomal o integrado en el ADN celular. Las desventajas fundamentales del SB son su gran complejidad técnica, duración de la misma y la necesidad de utilizar tejidos no fijados, puesto que existen protocolos para material fijado, su sensibilidad se reduce muy notablemente.
El blot invertido (BI) es una variante del SB. El ADN celular es marcado e hibridado con con diferentes DNA-HPVs, previamente digeridos y dispuestos en un filtro. El BI requiere una reacción individual para cada especímen, de sensibilidad inferior al SB (detecta 10 copias HPV/célula), se suele utilizar para tipar muchos genotipos en un espécimen.

 El dot/spot blot (DB) consiste en la extracción del ADN celular total y en su desnaturalización, después se fija a una membrana por medio de presión negativa en un aparato manifold. También se puede realizar la desnaturalización en la misma membrana. Una vez realizada la hibridación se produce la autorradigrafía, si se emplearon sondas calientes o el revelado enzimático, si se utilizaron frías. Con el DB se pueden analizar de una vez mas de 100 especímenes mientras que el SB no admite mas de 15. 

Uno de los problemas mas importantes del DB es el "fondo" provocado por las hibridaciones inespecíficas. Este problema se puede minimizar con el uso de sondas de ARN ya que los híbridos ARN-ADN tienen una Tm superior a los ADN-ADN y las hibridaciones inespecíficas pueden eliminarse con la aplicación de ARNasa (2).  

La hibridación sandwich (HS) no necesita extracción del ADN. Esta técnica utiliza una sonda con dos fragmentos separados, cada uno con una región complementaria con el ácido nucléico diana. Un fragmento se une al filtro y fija la secuencia específica de HPV al mismo. El segundo de los fragmentos está marcado y se fija al híbrido anclado en la membrana permitiendo su detección.La HS es un método con una especificidad estimada en 1-5 X 105 moléculas de ADN HPV (1 a 5 veces mas que el DB) y muy sensible (3 veces el DB).La HS tiene varios inconvenientes, por una parte solo un tipo de HPV puede ser analizado por muestra, además, para obtener buenos resultados se necesita un volumen importante de muestra, superior a 5 X 105 (3). 


 La hibridación Northern se utiliza para la detcción de RNA  de HPVs. El ARN celular se extrae y se separa por medio de un gel desnaturalizante que contiene formaldehido. Seguidamente se hibridan con sondas ARN antisense o ADN.
En todos los sistemas de hibridación descritos anteriormente el ácido nucléico diana está localizado en un soporte sólido, bien una membrana o una biopsia o extendido citológico, en los procedimientos que seguidamente describiremos el ácido nucleico se encuentra disuelto en un líquido.

Detalle de la tecnica de Southern
Esta técnica fue descrita por el Dr. Southern en 1975 y constituye el método más utilizado para analizar la estructura del ADN cortado por enzimas de restricción. Para la realización de esta técnica se debe extraer ADN genómico de linfocitos de sangre periférica para conocer el genotipo normal del individuo y ADN del tejido tumoral. 

Con una muestra de 10 cm3 de sangre se pueden extraer de 200 a 300 nanogramos de ADN con lo que se pueden realizar de 20 a 30 "digestiones" con enzimas de restricción.
Después de dicha digestión, el aproximadamente millón de fragmentos de ADN obtenidos, se separan entre sí, según su tamaño , en un gel de agarosa, sometido a un campo de corriente continua en una cubeta de electroforesis. El ADN posee una carga eléctrica negativa por lo que se desplaza hacia el polo positivo. Los fragmentos más pequeños se desplazan a mayor velocidad que los más grandes (Fig.).
Con el electroforesis convencional se separan fragmentos entre 100 y 30.000 pares de bases. Cuando se marca con un colorante fluorescente (bromuro de etidio), el ADN separado de esta forma, aparece como una mancha homogénea de material fluorescente debido a que existen demasiados fragmentos de ADN como para que puedan diferenciarse entre sí.




Representación esquemática de la técnica de Southern Blotting para el estudio de las secuencias específicas en el ADN genómico.



La técnica de Southern Blotting permite identificar uno o dos fragmentos de ADN de interés en el aparentemente uniforme colección de millón de fragmentos cortados con la enzima de restricción. El siguiente paso consiste en la desnaturalización de los fragmentos de cadena doble para obtener fragmentos de cadena única. Esto se logra con un bufer de Ph básico.

La molécula de cadena única es transferida desde el gel a una membrana de nilón o a papel de nitrocelulosa, ayudado por capilaridad.

La identificación de uno o más fragmentos de interés se logra con una sonda específica marcada con radioactividad o colorimetría. La sonda marcada se incuba con el filtro de nilón o nitrocelulosa en una solución que favorece la formación de ADN de doble cadena. Después de lavar el filtro, para retirar la sonda que no se unió a su cadena complementaria, el filtro se expone a un film de Rx durante 24 a 48 horas, para observar la posición de uno o más fragmentos a los que la sonda ha hibridizado, lo que se observa como una banda negra después del revelado.





10.3 TÉCNICAS DE CLONACIÓN DE GENES.

Consiste en la obtención de un gran número de fragmentos idénticos a partir de uno original. Para ello se aísla primero el fragmento de DNA que se quiere clonar, se liga a un transportador o vector (plásmidos, fagos , cósmidos etc..) que tras introducirlo dentro de una célula va a permitir su replicación por cultivo. Una vez replicado considerablemente se recupera junto con el vector correspondiente y posteriormente se le separa del vector, obteniendo como resultado un gran número de copias del fragmento de interés.




10.4  PRUEBAS DE PCR EN EL DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES GENÉTICAS POR MICROORGANISMOS / bacterias,protozoarios, entre otros).

Las aplicaciones actuales de la biología molecular para el diagnóstico clínico son muy variadas:

Genética
  • Diagnóstico prenatal
  • Tipaje de HLA
  • Reordenamientos genéticos
  • Detección de esperma aneuploide
  • Creación de mapas genéticos
 
Diagnóstico Microbiológico
·        Diagnóstico rápido de infecciones víricas
·        Detección de microorganismos en células infectadas/transformadas
·        Determinación de la relación génetica entre varios tipos de microorganismos similares
·        Correlacionar la presencia/expresión de agentes virales/infecciosos en tejidos
         neoplásicos.
·        Determinar la resistencia a los antibióticos de las bacterias.
·        Epidemiología de las infecciones
·        Detectar y cuantificar microorganismos difíciles de cultivar o para los que no existen
           reactivos serológicos.
·        Detectar regiones transformantes específicas en virus
 
 
Diagnóstico y clasificación de neoplasias y establecimiento de un pronóstico
·       Detectar reordenamientos de genes
·       Detectar reordenamientos en tumores humanos con anomalías consistentes cariotípicas
·       Detectar reordenamientos moleculares/anomalías de expresión genética en ausencia de alteraciones del cariotipo  
·        Estudio de la estructura/expresión de oncogenes
·        Detección de amplificación genética/resistencia a drogas
·        Diagnóstico de cell lineage en base a la expresión genética 



APLICACIONES PCR

La extraordinaria sensibilidad de la técnica de PCR, que permite detectar una copia viral en un millón de células es un arma de gran valor en la detección de infecciones HPV, especialmente en aquellas con un bajo número de copias víricas, como es el caso de la infección oculta. El problema mas importante de las técnicas de amplificación genómica es la contaminación de la reacción con ADNs extraños, en cualquiera de sus fases, produciendo resultados falsamente positivos. 

La adopción de medidas, como el uso de pipetas de desplazamiento vertical, de separación de especímenes y reactivos o de "primers" anticontaminación permiten la obtención de resultados fiables. Otra desventaja de la reacción de PCR es la no amplificación de genomas cuando no existen "primers" específicos, con la imposibilidad de detectar nuevos tipos de HPVs.   

La técnica PCR in situ adapta la tecnología habitual de la PCR a un corte histológico. Se puede utilizar un termociclador convencional con alguno "trucos" (3), o bien recurrir a un termociclador específico para PRC in situ 



10.5 TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
INTRODUCCIÓN

Uno de los más grandes avances de la ciencia contemporánea ha sido el desarrollo de la ingeniería genética y la biotecnología. Por medio de estas dos disciplinas –muy relacionadas entre sí– se ha logrado manipular genéticamente a los individuos con el fin de propiciarles nuevas características.

La tecnología del DNA recombínate es una técnica que ha permitido introducir material genético foráneo en un individuo, y hacer que éste organismo incorpore dicho material a su genoma y lo exprese como si fuera suyo. Esta tecnología desarrolló a partir del descubrimiento de las enzimas de y su acción sobre los ácidos nucleicos. Cuando se complementó el estudio de las enzimas de restricción con la micromanipulación (conjunto de técnicas que permiten inyectar y succionar porciones de una célula) se desarrolló esta nueva tecnología, que ha abierto las puertas a un nuevo y amplio campo de acción a la genética molecular.

El principio de la tecnología de DNA recombínate se basa en la inserción de un fragmento de DNA foráneo en un hospedero de clonaje molecular  por medio de un vector de clonaje, como ser un virus o un plásmido. Una vez que el fragmento de DNA foráneo se ha introducido en el hospedero, comienza el proceso de clonaje molecular y la recombinación, dando como resultado la expresión del gen o los genes introducidos en un organismo diferente.

En la actualidad existe una gran cantidad de aplicaciones de la tecnología de DNA recombinante a todo nivel. Se aplica esta técnica para la producción de vacunas, para la producción de proteínas, aminoácidos, vitaminas y ribonucleótidos y la producción de curas genéticas para algunas enfermedades, en el campo médico.
 La ingeniería genética en plantas también ha provisto la mejora de ciertas especies haciéndolas más resistentes o introduciendo ciertas características de otros individuos para mejorarlas.

Otra aplicación de la tecnología de DNA recombinante bastante reciente, es la producción de microorganismos transgénicos para procesos de bioremediación de hidrocarburos, metales pesados como el mercurio. Las técnicas de bioremediación permiten una descontaminación de ambientes afectados por medio del uso de microorganismos capaces de degradar ciertas sustancias, en muchos casos se han empleado organismos nativos del lugar pero también se ha trabajado con numerosas cepas modificadas genéticamente para amplificar su acción sobre los contaminantes.

PRINCIPIOS DE LA TECNOLOGÍA DE DNA RECOMBINANTE

Enzimas de restricción: producción de fragmentos de DNA para recombinación

Las enzimas de restricción o endonucleasas de restricción fueron descubiertas por Werner Aber, Hamilton Smith y Daniel Nathans. Estas son enzimas sumamente específicas que catalizan la hidrólisis de los enlaces fosfodiéster de los ácidos nucleicos y son capaces de cortar ambas hebras del DNA en lugares específicos, creando de esta manera una serie de fragmentos. Se ha visto que ciertas cepas de E. coli degradan (cortan) el DNA de ciertos virus fagos infectivos, a menos que los ácidos nucleicos presenten metilación (adición de grupos metilo) en algunos residuos de adenina o citosina del sitio de corte.

Tabla. Algunas de las principales enzimas de restricción conocidas y su origen (en base a Griffiths et al. 1998).

Enzima de restricción
Organismo de donde se extrae
EcoRI
Escherichia coli
EcoRII
Escherichia coli
HindII
Haemophilus influenzae
HindII
Haemophilus influenzae
HaeIII
Haemophilus aegyptius
HpaII
Haemophilus parainfluenzae
PstI
Providencia stuartii
Mayi
Serratia marcesens
BamI
Bacillus amyloliquefaciens
BglII
Bacillus globiggi






Las enzimas de restricción trabajan únicamente sobre secuencias específicas de bases nitrogenadas, el lugar donde se produce el corte se denomina sitio de restricción y producen dos tipos de corte:
(1) corte con extremos cohesivos y
(2) corte con extremos romos (ver Fig. ) (Griffiths et al. 1998).




 Producción de extremos (a) cohesivos y (b) romos, por medio de enzimas de restricción en hebras de DNA.


Otro método para producir fragmentos pequeños de DNA para recombinación consiste en emplear ultrasonidos. Los ultrasonidos son capaces de romper al DNA cromosomal en pequeños fragmentos. A pesar de ser un procedimiento muy sencillo, tiene la desventaja de producir fragmentos aleatorios y no permite aislar genes con gran precisión (Mateos 2000), sin embargo son empleados por su facilidad de uso.

Algunas enzimas de restricción como EcoRV encuentran el sitio de restricción, por medio de un barrido a lo largo del surco mayor del DNA y reconocen una secuencia palindrómica de seis nucleótidos de longitud, en la que se presenta una simetría rotacional binaria. Cuando la enzima de restricción encuentra el sitio de corte, se producen una serie de reordenamientos estructurales en el DNA y se produce un ajuste inducido en el cual el DNA sufre una torsión de 50 grados. En este proceso se va haciendo un barrido muy rápido sobre la hebra de DNA, leyendo grupos de seis nucleótidos, hasta encontrar la secuencia diana. Esto comprueba el carácter altamente específico de las enzimas de restricción.

Los puntos de corte de las enzimas de restricción pueden ser empleados como marcadores para la elaboración de mapas de restricción. Para elaborar un mapa de restricción, se tiñen los fragmentos resultantes de la lisis y se los separa mediante una electroforesis PAGE (Electroforesis en gel de poliacrilamida) y se establecen las distancias de migración, siendo los resultados muy específicos para cada molécula de DNA en estudio.

Los extremos cohesivos son los más empleados en la construcción de DNA recombinante, puesto que al tener una porción lineal "pegajosa" es más sencillo que se produzca la unión con el DNA del hospedero, por complementación de bases, dicha unión se produce por la intervención de enzimas denominadas ligasas. Adicionalmente, la enzima transferasa terminal puede ser usada para generar extremos cohesivos en un fragmento de DNA. A pesar de ser más difícil, también es posible realizar uniones de extremos romos, mediante la adición de conectores sintéticos de DNA que actúan a manera de extremos cohesivos (como el caso de la transferasa terminal), sin embargo este procedimiento no es de mucha utilidad para realizar una clonación directa de DNA.

Existe otro tipo de enzimas de restricción de doble función, denominadas endo–exonucleasas, las cuales son capaces tanto de añadir nucleótidos como de removerlos de una hebra de DNA. Estas enzimas también son muy específicas y reconocen secuencias exactas, plantea que las enzimas de restricción del tipo endo–exonucleasas pueden tener un papel fundamental en la reparación del DNA y/o en la muerte de células defectuosas, gracias a la especificidad de la enzima. Se han hecho numerosos experimentos con endo–exonucleasas aisladas de E. coli, Neurospora crassa, Aspergillus nidulans, mitocondrias de Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, células de mono y células leucémicas de humano.

MÉTODO


   Inserción de los fragmentos de ADN. Esta inserción se realiza en vectores de clonado, que son los agentes transportadores capaces de introducirlos en las células hospedadoras.     Los vectores de clonación son pequeñas moléculas de ADN, que tienen capacidad para autorreplicarse dentro de las células hospedadoras. 

Se utilizan con frecuencia dos tipos de vectores de clonación: plásmidos y virus. de introducirlos en las células hospedadoras.
Plásmidos. Son moléculas de ADN circular, con un tamaño menor que el del cromosoma. Se replican con independencia del cromosoma bacteriano ya que tienen su propio origen de replicación





  Métodos de introducción del vector. 

El siguiente paso será introducir el vector de clonación que contiene el gen que se quiere clonar en la célula hospedadora, para que ésta, al multiplicarse, origine un clon celular que lleve el gen concreto.
Existen varios métodos que dependerán del tipo de célula fundamentalmente.
En bacterias (células procariotas), mediante estos procesos:
-Transformación. Ocurre espontáneamente en ciertos tipos de bacterias y se consigue artificialmente sometiendo a la célula bacteriana a tratamientos físicos y químicos. 

La célula capta moléculas de ADN que se encuentran en el medio externo, las introduce en su interior y las incorpora a su genoma.

-Transducción. Este método consiste en introducir el ADN en la célula hospedadora mediante un virus, utilizando como vector de clonación el genoma del virus.
En la siguiente figura puede verse el proceso en tres etapas. El número 1 corresponde al virus aproximándose a una bacteria. Se puede observar como lleva un genoma ya con el gen que interesa clonar. El siguiente momento 2, corresponde al contacto entre el virus y la pared bacteriana, en cuya zona de contacto se produce un poro por donde como vemos en la etapa 3, el virus inyecta su ADN al interior de la célula bacteriana. 






Selección de celulas recombinanates.

Además del origen de replicación, los vectores de clonación deben llevar otros genes denominados marcadores, que sirven para identificar las células que contienen el vector de clonación. Se suelen utilizar como marcadores, genes de resistencia a antibióticos y genes de bioluminiscencia.

Genes de resistencia a antibióticos. Sirven para identificar bacterias que contienen el vector de clonación, porque estas bacterias serán resistentes al antibiótico del gen marcador.

Genes de luminiscencia.. En este caso, la célula que contenga el gen que se quiere clonar, tendrá la propiedad de emitir luz, ya que el marcador que se le incorpora determina que se exprese esa característica. Este sistema se emplea cuando la célula hospedadora es una célula eucariota.

Esquema general:









CONCLUSIÓN

el profesor cumplio con los objetivos anexados de todas las unidades , todo marcho bien de todo a todo en este curso.


BIBLIOGRAFIA































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